一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，包括有基礎培養(yǎng)基，還包括胎牛血清、人重組表皮生長因子、人重組成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、維生素C、皮質醇、霍亂毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺；本發(fā)明的人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，相對于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，能夠適用于多種血管內(nèi)皮細胞，有效促進細胞增殖和減小分裂時間，維持血管內(nèi)皮細胞的性狀，大大增加了體外人類血管內(nèi)皮細胞的傳代數(shù)和生存時間；同時本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液各個組分一般實驗室均可以獲得，配制方便，無需使用成品專用培養(yǎng)基，大大降低了培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的成本，適合推廣應用。
【專利說明】
_種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液及其培養(yǎng)方法?！颈尘凹夹g】
[0002]血管內(nèi)皮細胞不僅參與調解血管通透性和凝血過程，還在免疫調解，移植排斥，月中瘤轉移，炎癥等許多過程中也具有重要作用。在科研中常采用體外培養(yǎng)的方法來對血管內(nèi)皮細胞進行研究。由于目前大多數(shù)人仍不承認使用永生化的血管內(nèi)皮細胞系，故目前常規(guī)仍用從人身上純化血管內(nèi)皮細胞研究。而血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)，常常細胞增殖慢，細胞數(shù)代以后性狀發(fā)生改變，或者死亡，使研究成本變大，研究時間拉長。[〇〇〇3]血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)對于培養(yǎng)基營養(yǎng)要求較高，而提高生長速度，增加傳代次數(shù)，維持傳代后細胞性狀對于利用血管內(nèi)皮細胞體外研究多種疾病的顯得尤其重要。目前市場上比較成熟的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基主要有Lonza公司的EGM和EGM-2系列，以及Sciencell的 ECM培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)正常人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人微血管內(nèi)皮細胞都有相對不錯的效果，但配方保密且價格昂貴。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中的上述問題提出的一種能夠適用于多種血管內(nèi)皮細胞 (包括原代細胞和細胞株)，并且有效促進細胞增殖，減小分裂時間，同時成本相對低廉的人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液。
[0005]為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明所采用的技術措施為:一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，包括有基礎培養(yǎng)基，還包括胎牛血清、人重組表皮生長因子、人重組成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、維生素C、皮質醇、霍亂毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。
[0006]為了進一步優(yōu)化上述技術方案，本發(fā)明所采取的技術措施還包括:優(yōu)選地，上述基礎培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基及Wi 11 iams ’ s E培養(yǎng)基，或者其他任何適用的貼壁培養(yǎng)基；優(yōu)選地，上述培養(yǎng)液中還包括防污染組分、L-谷氨酰胺及肝素;進一步地，上述防污染組分選自青霉素、鏈霉素氨和兩性霉素B的一種或幾種；優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)液在每l〇〇ml的基礎培養(yǎng)液中包含:胎牛血清10-20ml青霉素10000U鏈霉素10000UL-谷氨酰胺1.25_1.5ml肝素2-20mg人重組表皮生長因子10-1000ng人重組成纖維細胞生長因子 100-2000ng 血管內(nèi)皮生長因子10-100ng胰島素樣生長因子0.1-5iig維生素C10-200yg皮質醇10-200yg霍亂毒素l-80iig氨基乙醇6.108-61.08yg磷酸乙醇胺14.106-141.06 yg;上述的各組分和比例可以進一步優(yōu)選為，每l〇〇ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中包含:胎牛血清l〇ml青霉素10000U鏈霉素10000UL-谷氨酰胺1.25ml肝素9mg人重組表皮生長因子500ng人重組成纖維細胞生長因子lOOOng血管內(nèi)皮生長因子50ng胰島素樣生長因子2yg維生素ClOOyg皮質醇lOOyg霍亂毒素l〇yg氨基乙醇30.54yg磷酸乙醇胺70.53yg。
[0007]另一方面，本發(fā)明還提供一種相應的人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，，包括以下步驟:步驟一，利用新鮮離體新生兒臍帶分離得到臍靜脈；步驟二，使用預熱的沖洗液對臍靜脈進行沖洗灌流；步驟三，利用預熱的消化液對步驟二處理后的臍靜脈進行灌流消化；步驟四，收集灌流消化液，進行離心洗滌，然后使用基礎培養(yǎng)基進行重懸并再次離心， 最后利用本發(fā)明上述的細胞培養(yǎng)液再次重懸，分離得到人類血管內(nèi)皮細胞；步驟五，將分離得到的人類血管內(nèi)皮細胞使用本發(fā)明上述細胞培養(yǎng)液稀釋，接入細胞板或細胞瓶，使用本發(fā)明上述的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
[0008]為了進一步優(yōu)化上述的人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，上述步驟二中預熱的沖洗液可以優(yōu)選為37 °C預熱的D-hanks溶液、PBS溶液或基礎培養(yǎng)液;上述步驟三中預熱的消化液可以優(yōu)選為37°C預熱的含有II型膠原酶或IV型膠原酶的D-hanks溶液;上述步驟五中的培養(yǎng)條件優(yōu)選為37 ± 1°C，5% C02，濕度為90%± 2%。
[0009]本發(fā)明采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，具有如下技術效果:首先，本發(fā)明的人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，相對于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，能夠適用于多種血管內(nèi)皮細胞，包括原代細胞和細胞株，同時可以有效促進細胞增殖和減小分裂時間；其次，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液中各個生長因子及組分的配合添加，能夠有效地維持了血管內(nèi)皮細胞的性狀，在體外擴充了 10代以后，細胞仍能有較大程度維持原有性狀，大大增加了體外人類血管內(nèi)皮細胞的傳代數(shù)和生存時間；再次，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液各個組分一般實驗室均可以獲得，配制方便，無需使用成品專用培養(yǎng)基，大大降低了培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的成本；最后，本發(fā)明使用的內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)方法開創(chuàng)新的使用灌流清洗和灌流消化的方式，使得分離得到的細胞分離度高，污染小，細胞活力和活率更高?！靖綀D說明】
[0010]圖1為實施例一中利用本發(fā)明的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮原代細胞 (HUVEC)傳5代與10代的細胞形態(tài)學比較圖。
[0011]圖2為實施例一中利用本發(fā)明的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮原代細胞 5代至9代平均傳代時間的比較圖；圖3為實施例一中本發(fā)明培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮原代細胞5代與10代后的細胞活率比較圖。
[0012]圖4為實施例一中利用本發(fā)明的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮原代細胞經(jīng)凍存復蘇后傳5代與10代后的細胞純度比較。
[0013]圖5為實施例二中利用本發(fā)明的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞 HMEC-1傳30代與50代后細胞形態(tài)學比較圖。
[0014]圖6為實施例二中利用本發(fā)明的培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞 HMEC-1傳20代至40代平均傳代時間的比較圖；圖7為實施例二中利用本發(fā)明培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1 20 代，35代與50代后的細胞活率比較圖。[〇〇15]圖8為實施例二中利用本發(fā)明培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1 20代后不同培養(yǎng)天數(shù)細胞的收獲量比較圖?！揪唧w實施方式】
[0016]本發(fā)明提供了一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，包括有基礎培養(yǎng)基，還包括胎牛血清、人重組表皮生長因子、人重組成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子、維生素C、皮質醇、霍亂毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。
[0017]下面通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0018]實施例一本實施例采用本發(fā)明的培養(yǎng)液、含10%胎牛血清的M199完全培養(yǎng)基及ciencecell的ECM 含血清培養(yǎng)基進行對比實驗，三種培養(yǎng)液分別為:本發(fā)明的培養(yǎng)液(改良培養(yǎng)基):在每百毫升DMEM/F12培養(yǎng)基的基礎上，加入如下組分:10ml胎牛血清，100U/ml青霉素， 100mg/ml鏈霉素，1.25ml L-谷氨酰胺，90iig/ml肝素，5ng/ml人重組表皮生長因子，10ng/ml人重組成纖維細胞生長因子，0.5ng/ml血管內(nèi)皮生長因子，20ng/ml胰島素樣生長因子，1 yg/ml維生素C，lyg/ml皮質醇。100 ng/ml霍亂毒素，lOyM氨基乙醇，lOOpM磷酸乙醇胺。[〇〇19 ]對照培養(yǎng)基A:含10%胎牛血清的Ml 99完全培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基B: Sciencecell的ECM含血清培養(yǎng)基細胞的分離過程采用一般的方法，取健康產(chǎn)婦分娩后的新生兒臍帶，長度>20cm，放入 4° C臍帶保存液中，lh內(nèi)送到細胞實驗室進行后續(xù)處理。在細胞實驗室的生物安全柜中對臍靜脈進行洗滌，用II型膠原酶消化，使內(nèi)皮細胞脫落。消化后的酶液平均分成3份，加入到預熱的三種含血清培養(yǎng)基中，收集的液體1000 rpm/min離心lOmin，棄上清，再加入相應培養(yǎng)基，置于60mm培養(yǎng)皿中放細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ±1°C，5% C02,濕度為90 ±2%。
[0020]原代細胞生長到密度為80%左右時，進行傳代，上清中懸浮細胞直接300g離心 5min，用新鮮預熱的培養(yǎng)基重懸。貼壁細胞用預熱的PBS洗滌2遍，加入500yl胰酶消化液，在培養(yǎng)箱中消化1 min，輕拍培養(yǎng)皿發(fā)現(xiàn)細胞脫落，加入相應的三種含血清培養(yǎng)基3 ml終止消化，300g離心5min，棄上清，再加入相應的完全培養(yǎng)基重懸細胞，與培養(yǎng)上清離心后的重懸細胞混合，調整細胞濃度為IX 105個/ml，接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長到密度達80%左右時按上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
[0021]結果分析:分別利用本發(fā)明的改良培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長，經(jīng)原代培養(yǎng)傳5代，三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞和原代細胞(第1代)相比都盡可能地保持了原有形態(tài)(圖1A)。原代培養(yǎng)10代后，改良培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖正常，對照培養(yǎng)基A和B培養(yǎng) 10代后增殖明顯減慢，并且形態(tài)明顯改變(圖1B)。
[0022]分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長，進行傳代平均時間的比較。如圖2所示，實驗結果表明，隨著傳代次數(shù)的增多，對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長速度顯著減緩，傳代間隔時間顯著增長(從第7代開始)，其與改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞存在顯著的統(tǒng)計學差異。
[0023]分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，傳代5次和10次細胞計數(shù)儀臺盼藍染色計算細胞活率。結果表明改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞活率明顯高于對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B(如圖3所示)。
[0024]分別利用本發(fā)明的改良培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長，傳代5次和10次時利用流式細胞計數(shù)對內(nèi)皮細胞標志物CD31和CD309進行染色，檢測培養(yǎng)后細胞純度，可以發(fā)現(xiàn)傳代5次時，三種細胞培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞純度能保持95%以上，傳代10次時，改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞純度仍能保持95%以上，對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞純度均降低到50%以下(如圖4所示)。
[0025]實施例二人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1的復蘇、傳代培養(yǎng)，凍存和再復蘇。所用三種細胞培養(yǎng)基詳見實施例1。
[0026]首先將本發(fā)明的改良培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B三種培養(yǎng)基按lml/5cm2 的培養(yǎng)基用量放入3個培養(yǎng)皿，放入37 ± 1°C，5% C02，濕度為90 ± 2%的培養(yǎng)箱內(nèi)預熱30min。
[0027]然后從液氮中取出同批凍存的HMEC-1細胞凍存管3支，迅速放入37° C水浴鍋進行化凍。等凍存液全部融化后，將凍存管中l(wèi)ml的凍存細胞轉移到已含有9ml無血清培養(yǎng)基的離心管中，800rpm/min離心5min，細胞沉淀用1 ml對應的完全培養(yǎng)基重懸后將細胞懸液加入到已預熱的三種培養(yǎng)基中，輕輕振蕩分散細胞。接種后16-24小時后進行培養(yǎng)基換液，此后48小時需再換液。[〇〇28] 復蘇后細胞生長到密度為80%以上時，進行傳代，貼壁細胞用預熱的roS洗滌2遍， 加入500yl胰酶消化液，在培養(yǎng)箱中消化1 min，輕拍培養(yǎng)皿發(fā)現(xiàn)細胞脫落，加入相應的三種含血清培養(yǎng)基3 ml終止消化，800rpm/min離心5min，棄上清，再加入相應的完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度為1 X 105個/ml，接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長到密度達80%以上時按上述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。[〇〇29]每傳代5次后，除繼續(xù)培養(yǎng)的細胞，其余細胞進行凍存，利用完全培養(yǎng)基+10%DMS0 的方法配置三種培養(yǎng)基相應凍存液，放入4° C預冷，細胞經(jīng)計數(shù)后800rpm/min離心5min，按5 X 106個/ml的濃度加入相應凍存液，重懸后放入凍存管，置于程序凍存盒后，放-80° C凍存， 24h后轉移入液氮罐。
[0030]液氮罐凍存2周后按上述復蘇方法進行重新復蘇培養(yǎng)。
[0031]結果分析:分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞 HMEC-1生長，經(jīng)細胞復蘇后傳30代，三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞和第1代細胞相比，都盡可能地保持了原有形態(tài)(圖5A)。細胞復蘇后培養(yǎng)50代后，改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞形態(tài)與對照培養(yǎng)基A和B相比，更好地保持了第一代細胞原有形態(tài)(圖5B)。
[0032]分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1生長，進行傳代平均時間的比較。如圖6所示，實驗結果表明，隨著傳代次數(shù)的增多，對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)HMEC-1細胞生長速度顯著減緩，傳代間隔時間顯著增長(從第30代開始)，其與改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞存在顯著的統(tǒng)計學差異分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞 HMEC-1生長，傳代20次，35次和50次時對細胞活率進行檢測，實驗結果表明，隨著傳代次數(shù)的增多，改良型培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞存活度高于對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)HMEC-1細胞 (如圖7所示)。
[0033]分別利用本發(fā)明的改良型培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基A和對照培養(yǎng)基B培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞HMEC-1生長，傳代20次，按照1*104 cell/cm2的密度接種10cm培養(yǎng)皿，計算細胞收獲量。實驗結果表明，改良型培養(yǎng)基細胞獲取率高，可明顯縮短細胞培養(yǎng)周期(如圖8所示)。
[0034]通過上述實施例能夠知道，本發(fā)明的人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，相對于傳統(tǒng)血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，能夠適用于多種血管內(nèi)皮細胞，包括原代細胞和細胞株，同時可以有效促進細胞增殖和減小分裂時間；有效地維持了血管內(nèi)皮細胞的性狀，在體外擴充了 10代以后， 細胞仍能有較大程度維持原有性狀，大大增加了體外人類血管內(nèi)皮細胞的傳代數(shù)和生存時間；同時本發(fā)明的細胞培養(yǎng)液各個組分一般實驗室均可以獲得，配制方便，無需使用成品專用培養(yǎng)基，大大降低了培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的成本，適合推廣應用。
[0035]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權項】
1.一種人類血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液，包括有基礎培養(yǎng)基，其特征在于，還包括胎牛血清、 人重組表皮生長因子、人重組成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因 子、維生素C、皮質醇、霍亂毒素、氨基乙醇及磷酸乙醇胺。2.根據(jù)權利要求1所述的細胞培養(yǎng)液，其特征在于，所述基礎培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、 DMEM/F12培養(yǎng)基、Ml99培養(yǎng)基及Wi 11 iams ’ s E培養(yǎng)基。3.根據(jù)權利要求2所述的細胞培養(yǎng)液，其特征在于，還包括防污染組分、L-谷氨酰胺及 肝素。4.根據(jù)權利要求3所述的細胞培養(yǎng)液，其特征在于，所述防污染組分選自青霉素、鏈霉 素氨和兩性霉素B的一種或幾種。5.根據(jù)權利要求4所述的細胞培養(yǎng)液，其特征在于，每100ml的基礎培養(yǎng)液中包含:胎牛血清10-20ml青霉素10000U鏈霉素10000UL-谷氨酰胺1.25_1.5ml肝素2-20mg人重組表皮生長因子10-1000ng人重組成纖維細胞生長因子100_2000ng血管內(nèi)皮生長因子10-100ng胰島素樣生長因子0.1-5iig維生素C10-200yg皮質醇10-200yg霍亂毒素l-80iig氨基乙醇6? 108-61.08 yg磷酸乙醇胺14.106-141.06 yg。6.根據(jù)權利要求5所述的細胞培養(yǎng)液，其特征在于，每100ml的DMEM/F12培養(yǎng)液中包含:胎牛血清l〇ml青霉素10000U鏈霉素10000UL-谷氨酰胺1.25ml肝素9mg人重組表皮生長因子500ng人重組成纖維細胞生長因子lOOOng血管內(nèi)皮生長因子50ng胰島素樣生長因子2yg維生素ClOOyg皮質醇lOOyg霍亂毒素l〇yg氨基乙醇30.54yg磷酸乙醇胺70.53yg。7.—種人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:步驟一，利用新鮮離體新生兒臍帶分離得到臍靜脈；步驟二，使用預熱的沖洗液對臍靜脈進行沖洗灌流；步驟三，利用預熱的消化液對步驟二處理后的臍靜脈進行灌流消化；步驟四，收集灌流消化液，進行離心洗滌，然后使用基礎培養(yǎng)基進行重懸并再次離心， 最后利用權利要求1-6任意一項所述細胞培養(yǎng)液再次重懸，分離得到人類血管內(nèi)皮細胞； 步驟五，將分離得到的人類血管內(nèi)皮細胞使用權利要求1-6任意一項所述細胞培養(yǎng)液 稀釋，接入細胞板或細胞瓶，使用權利要求1-6任意一項所述細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。8.根據(jù)權利要求7所述的一種人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步 驟二中預熱的沖洗液為37 °C預熱的D-hanks溶液、PBS溶液或基礎培養(yǎng)液。9.根據(jù)權利要求7所述的一種人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步 驟三中預熱的消化液為37 °C預熱的含有II型膠原酶或IV型膠原酶的D-hanks溶液。10.根據(jù)權利要求7所述的一種人類血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 步驟五中的培養(yǎng)條件為37 ± 1°C，5% C02，濕度為90%± 2%。
【文檔編號】C12N5/071GK105969720SQ201610614443
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】陸介元, 姚茜茜, 吳晶
【申請人】上海瑞鹿生物技術有限公司