耐輻射絲狀真菌f35及其在吸附鉛生物處理中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種耐輻射絲狀真菌F35及其在吸附鉛生物處理中的應(yīng)用，通過(guò)在新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)采集的土壤樣品中分離、篩選、選育、馴化，獲得一株對(duì)鉛離子具有高吸附特性的耐輻射單格孢屬真菌（Ulocladium sp.）F35 CGMCC No.11006，與常見(jiàn)真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，篩選出的菌株F35能在Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.01g/ml、pH=5、溫度為60℃、吸附時(shí)間為10min的情況下，對(duì)Pb2+具有最佳吸附效果，作為處理低濃度鉛污染廢水的生物菌，既可以利用菌體的生長(zhǎng)吸附鉛離子，也可以直接使用菌體吸附，具有去除率高、反應(yīng)速度快、無(wú)二次污染、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。CGMCC No. 1100620150709
【專利說(shuō)明】
耐輻射絲狀真菌F35及其在吸附鉛生物處理中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境生物治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐輻射絲狀真菌在重金屬生物吸附中應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類活動(dòng)的加劇，工業(yè)化、城市化、農(nóng)業(yè)集約化的快速發(fā)展，越來(lái)越多的重金屬污染物通過(guò)工業(yè)“三廢”、大氣沉降、未經(jīng)處理的固體廢棄物、污水灌溉向農(nóng)田轉(zhuǎn)移，累積到一定程度就會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生危害。目前，在我國(guó)土壤重金屬污染中鉛污染分布最廣，其具有強(qiáng)蓄積性和非移動(dòng)性的環(huán)境污染物，已成為目前水體和土壤污染的主要元素之一。農(nóng)田土壤被鉛污染后，會(huì)對(duì)農(nóng)作物和地下水產(chǎn)生次級(jí)污染，直接危害土壤微生物多樣性，并通過(guò)食物鏈影響人類健康。因此對(duì)重金屬鉛污染水體和土壤修復(fù)再利用的研究越來(lái)越受到人們的重視。
[0003]當(dāng)前對(duì)于重金屬水污染的治理主要包括物理、化學(xué)和生物的修復(fù)技術(shù)，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但總體上目前的修復(fù)技術(shù)存在效果緩慢，修復(fù)需要時(shí)間長(zhǎng)，成本高等缺點(diǎn)。如何提高現(xiàn)有技術(shù)的修復(fù)能力是人們關(guān)心的問(wèn)題之一。隨著技術(shù)的快速發(fā)展，生物修復(fù)技術(shù)由于其特殊的優(yōu)越性受到重視，而其中微生物修復(fù)是利用細(xì)菌、真菌等微生物表面生物大分子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞代謝、生物吸附以及氧化還原反應(yīng)等途徑對(duì)重金屬離子進(jìn)行吸收、沉淀、氧化還原等作用從而降低重金屬離子毒性的方法。相對(duì)于物理和化學(xué)方法對(duì)鉛的修復(fù)作用，微生物修復(fù)具有修復(fù)時(shí)間短、菌株繁殖快、相對(duì)處理費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境影響小、效率高、可就地進(jìn)行處理等優(yōu)點(diǎn)，但也存在微生物易受環(huán)境影響，不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。
[0004]微生物對(duì)含鉛廢水的修復(fù)作用，主要是通過(guò)吸附法、載體結(jié)合法、膜包法、共價(jià)結(jié)合法等。微生物對(duì)鉛的吸附作用主要取決于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，可以與重金屬離子發(fā)生定量的結(jié)合作用。目前吸附重金屬的微生物菌株主要集中在含有大量負(fù)電荷官能團(tuán)(如羧基、磷?；?、羥基等)，有很高絡(luò)合特性的絲狀真菌等;分泌一些如多糖、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，能通過(guò)離子交換或絡(luò)合作用與重金屬結(jié)合形成無(wú)毒或低毒金屬-有機(jī)化合物的細(xì)菌；以及通過(guò)菌絲體吸附作用來(lái)減少環(huán)境中存在的重金屬的內(nèi)生菌根和外生菌根。而耐輻射微生物是一類能夠在高輻射劑量下生存的極端微生物資源，對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的耐受性和吸附性，在重金屬污染治理方面有著極大的應(yīng)用潛力。
[0005]盡管目前有許多利用微生物修復(fù)治理壞境的報(bào)道，但是有關(guān)能夠篩選出性能穩(wěn)定且對(duì)鉛污染水體具有較高耐受性和較強(qiáng)的吸附性能的優(yōu)良菌種鮮見(jiàn)報(bào)道，因此需要進(jìn)一步探究微生物對(duì)重金屬鉛的吸附能力，為微生物修復(fù)重金屬鉛污染提供具有相對(duì)高吸附能力且性能穩(wěn)定的抗性菌株，對(duì)于治理鉛污染環(huán)境具有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)有關(guān)耐輻射絲狀真菌及其在吸附重金屬鉛中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道，且分離篩選的菌種對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的耐受性和吸附性的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在為微生物修復(fù)鉛污染提供具有相對(duì)高吸附能力且性能穩(wěn)定的抗性菌株。本發(fā)明通過(guò)在土壤樣品中分離篩選出一株對(duì)鉛離子有較高吸附特性的耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35CGMCC N0.11006，利用分離出的菌種對(duì)鉛污染水體進(jìn)行生物處理，并提供一種利用該菌進(jìn)行鉛污染水體生物處理中應(yīng)用技術(shù)方案。
[0007]本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案:
本發(fā)明土壤樣品由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所采自新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)，將采集的土壤樣品放置6qCo經(jīng)5000 KGy輻照后，以加鏈霉素的PDA培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，大量篩選優(yōu)選出一批生長(zhǎng)良好的耐輻射真菌菌株，從中篩選出一株對(duì)鉛離子具有高吸附特性的真菌菌株F35。利用本發(fā)明分離篩選出的編號(hào)為F35的真菌菌株對(duì)鉛污染水體進(jìn)行生物處理，該菌株在Pb2+濃度為100 mg/L、菌體添加量為0.01 g/ml、pH=5、溫度為60°C、吸附時(shí)間為10 min的情況下，對(duì)Pb2+具有最佳吸附效果。
[0008]本發(fā)明具體提供一種耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006，通過(guò)提供確定的的篩選方法，在采集的土壤樣品中分離篩選和培養(yǎng)，獲得一批真菌類微生物菌株，從中篩選出一株對(duì)鉛離子具有高吸附特性的真菌菌株F35，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株，暫命名為Ulocladium sp.35。
[0009]具體的，本發(fā)明通過(guò)對(duì)采集土壤樣品放置6QCo5000KGy輻照后，進(jìn)行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號(hào)為F35的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，該菌株屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期2015年7月9日，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.11006。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。該菌株最適生長(zhǎng)條件為:溫度30°C，培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水lL，pH自然)，培養(yǎng)時(shí)間48h;經(jīng)48h培養(yǎng)后，在PDA培養(yǎng)基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰。將菌種F35通過(guò)插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產(chǎn)孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色。根據(jù)以上形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)F35菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定，并結(jié)合分子生物學(xué)測(cè)序，初步鑒定該菌株為子囊菌門(mén)座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個(gè)種，暫命名為耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35。
[0010]提取菌株F35總DNA，采用真菌ITS區(qū)通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化，進(jìn)行生工測(cè)序。將實(shí)驗(yàn)菌株的所得ITS區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比較，確定實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合真菌生物多樣性研究中心數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的序列，利用MEGA 5.0軟件包采用鄰接法(Neighbor- Joiningmethod)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。
[0011 ] 通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株F35歸屬于單格孢屬(Ulocladium)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建顯示菌株F35單獨(dú)分枝，與目前已知菌株UlocIadium atrum UAMH 7840、Uloc ladiumcucurbitae HSAUP_XF030282、Ulocladium chartarum UAMH 7842、Ulocladium botrytisUB32、Ulocladium consortiale BMP 3151001、Ulocladium botrytis ATCC 18043具有最大同源性，相似性99.17%，與其余種相似性都在98.33%以下，尚不能確定其確切分類，暫命名為Ulocladium sp.F350
[0012]分子測(cè)序結(jié)果表明，耐輻射真菌F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列為547bp。本發(fā)明提供的耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35與常見(jiàn)的真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據(jù)菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學(xué)的綜合鑒定，編號(hào)為F35的菌種盡管與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據(jù)與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，其對(duì)重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強(qiáng)，從分類學(xué)將F35菌株鑒定為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0013]通過(guò)上述各試驗(yàn)對(duì)編號(hào)為F35的菌種與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據(jù)與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，初步鑒定該菌株為子囊菌門(mén)座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個(gè)種，從菌種分類角度將菌種編號(hào)為F35的菌株綜合鑒定為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0014]本發(fā)明進(jìn)而提供耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分尚和培養(yǎng)方法。
[0015]1.分離培養(yǎng)基采用:PDA培養(yǎng)基，每10ml培養(yǎng)基加1%鏈霉素溶液0.3ml，同時(shí)加入鉛離子溶液，使其濃度達(dá)2000mg/L。
[0016]2.分離和篩選條件:采取梯度稀釋法，稱取1g輻照后的采集土壤樣品于90ml無(wú)菌生理鹽水中，30°C活化30min后進(jìn)行梯度稀釋，選取原液、10—\ 10—2、10—3稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置30°C培養(yǎng)，待長(zhǎng)出真菌菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應(yīng)的平板，直至無(wú)雜菌落。
[0017]經(jīng)培養(yǎng)篩選確定的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006在TOA培養(yǎng)基上菌株菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰;PDA培養(yǎng)基選用馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然。
[0018]進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006在鉛污染水體生物處理中應(yīng)用。通過(guò)研究在不同鉛離子濃度、溫度、pH值、接種量和吸附時(shí)間條件下對(duì)菌體吸附的影響，得到F35對(duì)Pb2+的最佳吸附條件是Pb2+濃度100mg/L、菌體添加量0.0I g/ml、pH=5、溫度60 °C、吸附時(shí)間I Omin。
[0019]通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
【發(fā)明內(nèi)容】
，可以達(dá)到以下有益效果:
(I)本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006，具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，繁殖快的優(yōu)點(diǎn)。
[0020](2)本發(fā)明分離篩選的編號(hào)為F35的耐輻射單格孢屬真菌菌株能夠在能在Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.01g/ml、pH=5、溫度為60°C、吸附時(shí)間為1min的情況下，對(duì)Pb2+具有最佳吸附效果，是一種典型的耐輻射真菌。
[0021](3)本發(fā)明在處理低濃度鉛污染廢水過(guò)程中，既可以利用菌體的生長(zhǎng)吸附鉛離子，也可以直接使用菌體吸附，具有去除率高、反應(yīng)速度快、無(wú)二次污染、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的菌落和菌體照片，其中，A-菌落照片，B-菌體照片。
[0023]圖2所示為所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)狀圖。
[0024]圖3所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006鉛離子濃度對(duì)吸附效果的影響圖。
[0025]圖4所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006鉛離子初始pH對(duì)吸附效果的影響圖。
[0026]圖5所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006菌體用量對(duì)吸附效果的影響圖。
[0027]圖6所示為耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附溫度對(duì)吸附效果的影響圖。
[0028]圖7所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006的吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響圖。
[0029]圖8所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附鉛離子前紅外光譜圖。
[0030]圖9所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附鉛離子后紅外光譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的%都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0032]實(shí)施例一:耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分離、篩選及鑒定
1、菌種的分離和篩選
本發(fā)明所使用的單格孢屬真菌(Ulocladium sp.F35)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所從新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)大量采集土壤中取樣，經(jīng)5000 KGy鈷源進(jìn)行輻照后分離，利用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法分離出土層中的真菌，平板劃線法純化菌株，以不同的培養(yǎng)溫度、PH值、培養(yǎng)基為富集條件，經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選出一批生長(zhǎng)良好的真菌菌株，從中優(yōu)選出一株編號(hào)為F35的菌株。
[0033]分離步驟:
(I)分離培養(yǎng)基采用:PDA培養(yǎng)基，按照每10ml的PDA培養(yǎng)基加1%鏈霉素溶液0.3ml，同時(shí)加入鉛離子溶液，使其濃度達(dá)2000mg/L。
[0034](2)分離和篩選條件:采取梯度稀釋法，稱取1g輻照后的土壤樣品于90ml無(wú)菌生理鹽水中，30°C活化30min后進(jìn)行梯度稀釋，選取原液、10—\10—2、10—3稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置30°C培養(yǎng)。待長(zhǎng)出真菌菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應(yīng)的平板，直至無(wú)雜菌落。
[0035]2、菌株的培養(yǎng)條件
(I)編號(hào)為F35的菌株的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然，經(jīng)30 °C、48 h培養(yǎng)。
[0036](2)編號(hào)為F35的菌株在28-30°C條件下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時(shí)間為 48h。
[0037](3)編號(hào)為F35的菌株的生長(zhǎng)pH自然。
[0038](4)編號(hào)為F35菌株的重金屬耐受能力實(shí)驗(yàn)。
[0039]將該菌種分別接種于含8種重金屬離子，Pb2+濃度范圍在1500-3500mg/L、Cd2+的濃度范圍在50-250mg/L、Hg2+的濃度范圍在400-1200mg/L、Cu2+的濃度范圍在700-1500mg/L、Cr2+的濃度范圍在700-1500mg/L、Co2+的濃度范圍在400-1200mg/L、Zn2+的濃度范圍在800-2000mg/L、Ni2+的濃度范圍在700-1500mg/L的平板上，于30°C進(jìn)行培養(yǎng)，7d后觀察其生長(zhǎng)狀況。耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35對(duì)不同重金屬離子的耐受性檢測(cè)結(jié)果為:本發(fā)明所用的菌種對(duì)8種重金屬離子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有較高的耐受特性，分別能耐受 3500mg/L、250mg/L、400mg/L、700mg/L、1500mg/L、1200mg/L、2000mg/L、1300mg/L濃度的重金屬離子溶液，結(jié)果表明，該菌種對(duì)于重金屬離子Pb2+的耐受性最高，在重金屬生物處理中具有良好的應(yīng)用前景。
[0040]具體的，本發(fā)明通過(guò)對(duì)采集土壤樣品以5000KGy鈷源進(jìn)行輻照，進(jìn)行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號(hào)為F35的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，該菌株屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株。該菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期2015年7月9日，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0.11006。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為耐輻射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35。該菌株最適生長(zhǎng)條件為:溫度30°C，培養(yǎng)基采用I3DA培養(yǎng)基，馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然，培養(yǎng)時(shí)間48h;經(jīng)48h培養(yǎng)后，在I3DA培養(yǎng)基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰。將菌種F35通過(guò)插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產(chǎn)孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色。根據(jù)以上形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)F35菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定，并結(jié)合分子生物學(xué)測(cè)序，初步鑒定該菌株為子囊菌門(mén)座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個(gè)種，暫命名為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0041 ] 分子測(cè)序結(jié)果表明，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列為547bp，本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006與常見(jiàn)真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據(jù)菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學(xué)的綜合鑒定，編號(hào)為F35的菌種盡管在生理生化特性和分子水平方面與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種具有明顯的差異，與常見(jiàn)的真菌菌種相比，其對(duì)重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強(qiáng)，但是依據(jù)分類學(xué)鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0042]3、菌株F35的生理生化鑒定
形態(tài)特征:該菌種F35經(jīng)TOA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，在I3DA培養(yǎng)基上菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰，挑取疑似單格孢屬真菌菌落進(jìn)行插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產(chǎn)孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色，耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35菌落和菌體形態(tài)參見(jiàn)附圖1。
[0043]生理生化特征:對(duì)該菌進(jìn)行了糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化鑒定，該菌株F35在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，經(jīng)B1log FF鑒定板試驗(yàn)，結(jié)果表明菌株F35可以利用N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、杏苷、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、熊果苷、D-纖維二糖、糊精、赤藻糖醇、D-果糖、D-半乳糖、龍膽二糖、a-D-葡萄糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸鹽、D-葡萄醛酸、丙三醇、肝糖、2_酮-D-葡萄糖酸、a-D-乳糖、乳果糖、麥芽糖醇、麥芽糖、麥芽三糖、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、a-甲基-D-半乳糖苷、甲基-D-葡萄糖苷、6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-核糖、水楊苷、D-山梨醇、水蘇糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、D-木糖、y-氨基丁酸、反丁烯二酸、a-酮戊二酸、L-蘋(píng)果酸、奎尼酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、鳥(niǎo)氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-絲氨酸、2-氨基乙醇。
[0044]通過(guò)上述菌種耐福射單格抱屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定，即通過(guò)菌體形態(tài)觀察、菌株培養(yǎng)特征觀察、生長(zhǎng)溫度測(cè)定、耐性試驗(yàn)等試驗(yàn)，與常見(jiàn)的菌種相比，對(duì)8種重金屬離子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有較高的耐受特性，參照《真菌鑒定手冊(cè)》的方法進(jìn)行，編號(hào)為F35的菌種盡管與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據(jù)與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，初步鑒定該菌株為子囊菌門(mén)座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個(gè)種，從菌種分類角度將菌種編號(hào)為F35的菌株綜合鑒定為耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 ο
[0045]實(shí)施例二:耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006分子水平鑒定
1.DNA提取:真菌提取方法如下:
(l)200mg菌體，液氮研磨，加入3ml 3% CTAB提取緩沖液，65°C水浴45min，4°C4000r/min 離心 20mino
[0046](2)取上清轉(zhuǎn)到離心管中，加入4μ1 10mg/ml蛋白酶，37°C，水浴lh。
[0047](3)加入800μ1 Tris飽和酚，搖勻13000r/min離心1min;取上清。
[0048](4)加入等體積的氯仿/異戊醇，搖勻，13000r/min離心lOmin，取上清。
[0049 ] (5 )加10mg/ml的RNA酶，37 °C水浴過(guò)夜處理。
[0050](6)加入800μ1氯仿/異戊醇，搖勻，13000r/min離心lOmin，取上清。
[0051 ] (7)加600μ1異戊醇，-20 V沉淀30min，收集沉淀，75%酒精，沖洗，超凈臺(tái)真空干燥。
[0052](8) 100μ1 TE 溶解DNA，_20 °(:保存?zhèn)溆?。加入Ι?的RNA酶，37°C水浴lh，加入400μ?氯仿/異戊醇(24:1)，12000r/min離心lOmin，重復(fù)2次。
[0053]2.1TS基因基因擴(kuò)增及測(cè)序，用真菌ITS基因基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增:
引物 ITS11:5 ’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’
ITS14: 5 ’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為5(^1^，反應(yīng)條件為:95°(:，5111丨11;95°(:，458，57°(:，30s，72°C，90s，30cycles，72° C，7min。擴(kuò)增產(chǎn)物(約547bp)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將菌株F35的ITSl基因序列進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)測(cè)定，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006基因序列為547bp，參見(jiàn)附后提供的基因序列表SEQUENCE LISTING。
[0054]3.1TSl序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析
本發(fā)明通過(guò)總DNA的提取、ITSI基因基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得547bp序列，經(jīng)GenBank \ Blast同源序列比對(duì)分析，其與現(xiàn)有技術(shù)所報(bào)道的單格孢屬(Ulocladium sp.)同源性較高。從GenBank中獲取標(biāo)準(zhǔn)菌株ITSl基因序列，進(jìn)行同源進(jìn)化分析、CLUSTAL X進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用MEGA 5.0軟件中的Saitou和Nei的鄰接法(Neighbor Joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，結(jié)果參見(jiàn)附圖2。從樹(shù)狀圖中可以看出，本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006與常見(jiàn)真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據(jù)菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學(xué)的綜合鑒定，編號(hào)為F35的菌種盡管在生理生化特性和分子水平方面與常見(jiàn)的單格孢屬真菌菌種具有明顯的差異，與常見(jiàn)的真菌菌種相比，其對(duì)重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強(qiáng)，但是依據(jù)分類學(xué)鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0055]
實(shí)施例三:耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006菌體的制備將經(jīng)活化的本發(fā)明菌株耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006接種于裝有100ml PDA液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30°C培養(yǎng)，200rpm振蕩培養(yǎng)72h。利用真空栗抽濾的方式收集菌體，用無(wú)菌水洗滌三次后待用。
[0056]實(shí)施例四:一種耐輻射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006在吸附鉛生物處理中的應(yīng)用
將該菌株接種于不含鉛離子的液體PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5天后，收集菌絲體，進(jìn)行菌體吸附試驗(yàn)，研究在不同鉛離子濃度、溫度、PH值、接種量和吸附時(shí)間條件下對(duì)菌體吸附的影響。
[0057](I)不同鉛離子濃度對(duì)耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別置于1ml鉛離子濃度為50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L的Pb2+溶液中，靜置吸附3 h后，測(cè)定不同鉛溶液濃度對(duì)菌體吸附的影響。結(jié)果見(jiàn)附圖3，隨著Pb2+濃度的降低吸附率逐漸升高，在Pb2+達(dá)到100mg/L時(shí)吸附率最高，達(dá)66.19%，隨后下降，因此在鉛溶液濃度為100 mg/L時(shí)，體現(xiàn)了該菌體對(duì)鉛離子的吸附能力最強(qiáng)。
[0058](2)不同鉛離子初始pH值對(duì)耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別置于1ml鉛離子濃度為100mg/L，pH值為3、4、5、6、7、8、9的Pb2+溶液中，靜置吸附3h后，測(cè)定不同pH值對(duì)菌體吸附的影響。結(jié)果見(jiàn)附圖4，pH值在5時(shí)菌株對(duì)Pb2+溶液吸附率最高，達(dá)70.66%。當(dāng)pH值升高和降低時(shí)吸附率均降低，因此，溶液pH值為5時(shí)，體現(xiàn)了該菌體對(duì)鉛離子的吸附能力最強(qiáng)。
[0059](3)不同菌體用量對(duì)耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
分別稱取不同質(zhì)量的菌體(0.18，0.38，0.58，0.78，1.(^)分別置于101111鉛離子濃度為lOOmg/L的溶液中，靜置吸附3 h后，測(cè)定不同質(zhì)量菌體對(duì)吸附的影響。結(jié)果見(jiàn)附圖5，菌體用量在0.5 g-1.0 g時(shí)吸附率差異不大，1.0g時(shí)吸附率最高，達(dá)92.19%。但考慮菌體用量過(guò)大，成本較高，實(shí)際操作困難，因此選取吸附率也較高的0.1g菌體做后續(xù)試驗(yàn)。
[0060] (4)不同吸附溫度對(duì)耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，震蕩懸浮于1ml鉛離子濃度為100mg/L的Pb2+溶液中，分別置于20-80°C水浴中靜置吸附3h后，測(cè)定不同溫度對(duì)菌體吸附的影響。結(jié)果見(jiàn)附圖6，溫度在60°C時(shí)菌株對(duì)Pb2+溶液吸附率最高，達(dá)81.91%，說(shuō)明該菌株在較高溫度條件下也具有很高的吸附能力。
[0061 ] (5)不同吸附時(shí)間對(duì)耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別震蕩懸浮于1ml鉛離子濃度為100 mg/L的Pb2+溶液中，每間隔5min取樣，測(cè)定不同時(shí)間對(duì)菌體吸附的影響。結(jié)果見(jiàn)附圖7，該菌在1min內(nèi)即完成吸附，1min后吸附率變化不大，趨于飽和，說(shuō)明該菌株在1min時(shí)對(duì)鉛離子的吸附率最高。
[0062]綜合以上步驟，可知F35對(duì)Pb2+的最佳吸附條件是Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.0I g/ml、pH=5、溫度為60 °C、吸附時(shí)間為I Omin。
[0063]實(shí)施例五:紅外光譜分析
將F35在含0mg/L和100mg/L的Pb2+的TOA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別用去離子水洗滌3次，后抽濾收集菌體，烘干，與KBr研磨混勾，在10t/cm2下壓成薄片并維持Imin，用紅外光譜儀測(cè)定并記錄其光譜。參見(jiàn)附圖8可知，耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附Pb2+前后的紅外光譜變化明顯。
[0064]由附圖8，附圖9顯示，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附前后紅外圖譜呈現(xiàn)出明顯的差異，說(shuō)明吸附前后菌體的結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)發(fā)生了改變。3229cm—1的N-H酰胺或O-H伸縮振動(dòng)偏移至3402cm—1處，且吸收峰變寬，但吸收強(qiáng)度變化不大;2924cm—1和2855cm—1的C-H飽和振動(dòng)沒(méi)有發(fā)生明顯的偏移，但吸收強(qiáng)度增幅變大；1742cm—1的C=O酯基振動(dòng)也沒(méi)有發(fā)生明顯的偏移，但吸收強(qiáng)度明顯增大；1646cm—1的C=O酰胺振動(dòng)略有偏移，且吸收強(qiáng)度增幅變大；1554cm—1的N-H振動(dòng)偏移至1545cm—1處，且吸收強(qiáng)度增幅變大；1456cm—1和1385cm—1的伯酰胺振動(dòng)偏移不大，但吸收強(qiáng)度增幅變大。吸收前1160cm—1至1031cm—1為伯醇C-O和OH振動(dòng);吸收后1315cm—1和1239cm—1為伯醇O-H振動(dòng)，發(fā)生了較大的偏移，1077cm—1和1038cm—1為伯醇C-O振動(dòng)，偏移較??；同時(shí)這幾個(gè)吸收峰的吸收強(qiáng)度增幅變大。由此表明，細(xì)胞表面的這些官能團(tuán)在吸附鉛離子的過(guò)程中起到了配位絡(luò)合作用。
[0065]上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種耐福射單格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35，其特征在于，所述的耐福射單格孢真菌(Ulocladium sp.)F35 的CGMCC保藏號(hào)為N0.11006。2.如權(quán)利要求1所述耐福射單格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35在吸附鉛生物處理中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105886407SQ201610061361
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日
【發(fā)明人】顧美英, 譚慧林, 張志東, 宋素琴, 王瑋, 朱靜, 唐琦勇, 謝玉清, 張麗娟, 王博
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所