一種熒光增強型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光增強型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應用，屬于分析化學技術領域。該探針分子的分子式為：C21H14N4O2S，其結構式如式（Ⅰ）所示：。本發(fā)明設計的硫化氫熒光探針，制備簡單、合成路線成熟，能夠對細胞中的硫化氫進行快速準確檢測并可以熒光成像，可應用于水環(huán)境和生物細胞體系中硫化氫的含量傳感檢測，在生物分子檢測領域具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
一種熒光増強型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光增強型硫化氫分子熒光探針及其制備方法和應用，屬于分析 化學技術領域。
【背景技術】
[0002] 硫化氫（H2S)，在生物體內由酶催化產生，并且在調節(jié)人的生理機能方面扮演著 重要的角色。例如，硫化氫可參與血紅蛋白改變;參與體內亞硝基類化合物的還原；調節(jié)體 內多種酶的功能；調節(jié)神經細胞和神經內分泌;舒張血管平滑肌;保護胃黏膜，減小壓力的 作用;硫化氫能夠有效清除過氧化氫、超氧陰離子、次氯酸、過氧亞硝基等。實驗表明硫化氫 能夠有效地降低AP誘導的神經細胞毒性。硫化氫與FPG表現(xiàn)為負比例關系，升高二型糖尿病 病人硫化氫濃度也許有助于降血糖。但是，生物體內硫化氫失調則會對機體產生危害，比如 老年癡呆癥，唐氏綜合癥，糖尿病，肝硬化等。所以實現(xiàn)生物體內硫化氫的檢測具有極其重 要的意義。
[0003] h2s作為人體內重要的信號分子，在生物體內濃度變化較快，所以探針要有一定的 響應速度，以實現(xiàn)生物體內硫化氫的實時檢測。復雜的生物環(huán)境會干擾硫化氫檢測，尤其是 硫醇的干擾。同時生物體系內還有多種陰離子，都可能對探針的效果產生影響，探針必須具 有高度的選擇性。此外，要實現(xiàn)水溶液中硫化氫的高效傳感和生物體內細胞成像，所以設計 的硫化氫探針要有低的熒光背景和高的熒光響應信號。
[0004] 目前，多數(shù)的硫化氫熒光探針選擇性不高，并且對硫化氫檢測顏色變化不明顯，對 硫化氫響應的熒光信號增強倍數(shù)不高，很難實現(xiàn)檢測水溶液和細胞內的硫化氫。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對目前硫化氫分子熒光探針檢測所面臨的問題和現(xiàn)狀，本發(fā)明通過分子設計， 合成出一種具有焚光信號強和高選擇性的硫化氫分子焚光探針。本專利基于硫化氫對疊氮 具有良好的還原性并結合激發(fā)態(tài)分子內質子轉移(ESIPT)機理設計的硫化氫熒光探針，探 針對硫化氫具有較強的熒光信號的響應（熒光信號強度可以增強400多倍），具有良好的選 擇專一性。能夠對水溶液中和細胞內的硫化氫進行熒光成像應用。
[0006] 本發(fā)明采用以下技術方案： 一種熒光增強型硫化氫分子熒光探針，其特征在于，所述探針分子的分子式為： C21HWN4O2S，其結構式如式（I)所示：
[0007] 一種上述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步驟： 1) 將leq的鄰甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱回流24小時，然 后分離提純得到化合物1-1;所述化合物1-1結構式如下：
2) 將leq的化合物1-1，leq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加熱回流反應過夜，分 離提純得到化合物1 -2;所述化合物1 -2結構式如下：
3) 將leq化合物1-2與1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮氣保護，室溫回流反應24小時后，分離 提純得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的結構式如下：
4) 將leq化合物1-3溶于四氫呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮氣保護，室溫 反應17小時，將反應液用3M鹽酸溶液酸化，然后分離提純得到化合物1-4;所述化合物1-4結 構式如下：
5) 將leq水楊醛與leq鄰氨基苯硫酚，leq的Na2S205溶解在DMF中，氮氣保護，加熱回流反 應2-3小時，反應完全后，分離提純得到化合物2-1;所述化合物2-1的結構式如下：
6)將leq化合物2-1與leq的化合物l-4，leq的DMAP，leq的DCC溶于二氯甲烷中，氮氣保 護，室溫反應8小時，分離提純得到目標探針化合物FN3_H2S。
[0008] 所述步驟1)中分離提純方法為:反應液中加入適量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3 次，鹽水洗2-3次，無水硫酸鈉干燥，然后柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。
[0009] 所述步驟2)中分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0010] 所述步驟3)中分離提純方法為：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無 水硫酸鈉干燥，柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0011] 所述步驟4)中分離提純方法為:用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無水 硫酸鈉干燥，柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0012] 所述步驟5)中分離提純方法為:反應液倒入大量水中產生固體，然后減壓過濾，真 空干燥，得到純產品。
[0013] 所述步驟6)中分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0014] 上述的硫化氫熒光探針的合成路線如下：
本發(fā)明所述的硫化氫分子熒光探針的應用，該熒光探針可以應用于水環(huán)境和生物細胞 體系中硫化氫的含量傳感檢測;所述的傳感檢測包含熒光檢測，目視定性檢測，細胞成像檢 測。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點：（1)探針的合成路線相對簡單，且后處理過程容易；（2)本發(fā)明實現(xiàn) 了硫化氫分子探針的快速檢測，具有選擇性好、抗干擾能力強的特點。此外，用肉眼就可以 明顯的觀察到溶液顏色的變化和紫外燈下較強熒光變化，是一種具有生色傳感功能的熒光 探針。其顯著的顏色和熒光強度變化，使該探針展現(xiàn)了在水溶液中和生物細胞內高選擇性， 高靈敏度檢測硫化氫分子，可進行實時定性及定量的目視比色法檢測。故而，本發(fā)明是一種 簡單，快速，靈敏的硫化氫分子特異性檢測試劑，在生物分子檢測領域具有廣闊的應用前 景。其性能將在實施例中結合附圖給予詳細說明。
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例1中探針FN3-H2s的1H NMR圖譜； 圖2是探針FN3-H2S隨硫化鈉的加入熒光譜圖的變化情況； 圖3是探針FN3-H2S對不同離子和分子的選擇性熒光譜圖； 圖4是探針FN3-H2S對不同離子和分子的選擇性柱狀圖數(shù)據(jù)； 圖5是探針FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液顏色的變化； 圖6是探針FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液用紫外燈照射后熒光強度的變化； 圖7是探針FN3-H2S對外源性硫化氫進行生物細胞成像。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限 制，實施例中化合物的號碼對于上述方案中化合物的號碼。
[0018] 實施例1 化合物FN3-H2s硫化氫熒光探針的合成 (1)化合物1-1的合成：
將鄰甲基苯甲酸(5.0g，36.7mmol，leq)溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱 回流24小時，用TCL板檢測反應，反應完全后，冷卻，加入20mL水，用二氯甲燒萃取，水洗2-3 次，鹽水洗2-3次無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆 粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:1，產量為89%。
[0019] ⑵化合物1-2的合成：
將化合物 1-1(1.97g，12mmol，leq)，NBS(2.35g，13.2mmol，leq)，AIBN(98.4mg， 0.6mmol，0.05 eq)溶于20mL乙腈中，加熱回流反應過夜，用TCL板檢測反應，反應完全后， 減壓旋干溶劑后得粗產品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比 為二氯甲烷/石油醚=1:1，產量為56%。
[0020] (3)化合物1-3的合成：
將化合物1-2(1.18,4.53!11111〇1，169)溶于311^01^中，然后加入疊氮化鈉（35311^， 5.43mmol，1.2eq)，氮氣保護，室溫反應24小時，用TCL板檢測反應，反應完全后，乙酸乙酯 萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，減壓旋干溶劑后得粗產品，并用硅 膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:2,產量為 82%〇
[0021] (4)化合物1-4的合成：
將化合物1_3(90〇11^，4.41]11]1〇1，169)溶于1〇1111^1'冊中，加入2 1111^甲醇，4 1]11^水，然后再 加入LiOH( 528mg，22mmol，5eq)，氮氣保護，室溫反應17小時。用TCL板檢測反應，反應完全 后，將反應液用3M鹽酸溶液酸化，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無水硫酸鈉 干燥，減壓旋干溶劑后得粗產品，并用硅膠柱進行分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑 配比為二氯甲烷/石油醚=1:2，產量為86%。
[0022] (5)化合物2-1的合成：
將水楊酸（961mg，7.87mmol, leq)和Na2S2〇5(1.5mg，7.87mmol, leq)溶于 10mL DMF中， 然后再加入鄰氨基苯硫酚（1. 〇g，7.87mmol，leq)，氮氣保護，加熱回流反應2-3小時，用TCL 板檢測反應，反應完全后，冷卻，將其倒入200mL水中，有固體產生，減壓過濾，真空干燥，得 到純產品。產量為92%。
[0023] (6)化合物FN3_H2S的合成：
將化合物 1-4(9 .lmg，0.528mmol，leq)，化合物2-1( 100mg，0.528mmol，leq)，DMAP (201mg，0.528mmol，leq, DCC(136mg，0.528mmol，leq)溶于5mL二氯甲烷中，氮氣保護，室 溫反應8小時，用TCL板檢測反應，反應完全后，減壓旋干溶劑后得粗產品，并用硅膠柱進行 分離，硅膠顆粒大小為200-300目，洗脫劑配比為二氯甲烷/石油醚=1:1，產量為81%。該探針 的 1H-NMR (400MHz，DMS〇-t/6)(見圖 1)δ 8.40 (d，/= 7.4 Hz, 1H)，8.31 (d，/= 7.5 Hz, 1H), 8.09 (d, /= 7.8 Hz, 1H), 7.83 (dd, /= 19.6, 7.6 Hz, 2H), 7.71 (dd, /= 15.9, 7.5 Hz, 3H), 7.58 (t, /= 7.5 Hz, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 1H), 7.44 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H) 實施例2 化合物FN3-H2S硫化氫熒光探針隨Na2S加入當量的增加熒光譜圖的變化 取實施例1制備的FN3-H2S硫化氫熒光探針溶于二甲基亞砜(DMSO)中，制成lmmol/L儲 備液。從儲備液中取出40yL加入到5mL的離心管當中，用PBS緩沖溶液(0. lmo 1 /L，pH=7.4) 與DMSO體積比為3 :1的溶液稀釋至4 mL，加入不同當量（0-100 eq)的Na2S標準溶液，以 410nm為激發(fā)光測量其熒光性質。熒光光譜如圖2所示。由圖2可見，隨著Na 2S加入當量的增 加熒光強度逐漸增強。
[0024] 實施例3 化合物FN3-H2s熒光探針對不同分子或離子的選擇性 從實施例2中熒光探針儲備液中取出40yL加入到5mL的離心管當中，用PBS緩沖溶液 (0.1mol/L，pH=7.4)與DMS0體積比為3:1的溶液稀釋至4 mL，配制一系列探針溶液，分別加 入等摩爾量的競爭分子和等摩爾量的硫化鈉標準溶液，其中一個溶液不加離子作為空白對 照，lh后以410nm為激發(fā)光檢測溶液的熒光發(fā)射光譜變化，結果如圖3和圖4所示。由圖3和 圖4可以發(fā)現(xiàn)，其他離子對化合物FN 3-H2S的熒光幾乎沒有影響，而硫化鈉溶液的加入使化 合物FN3-H 2S的熒光顯著增強。
[0025] 實施例4 化合物FN3-H2s熒光探針對硫化氫的可視化檢測 從實施例2中熒光探針儲備液中取出40yL加入到5mL的離心管當中，加入100摩爾當 量的硫化鈉標準溶液，硫化鈉可以使合物FN3-H2S熒光探針的PBS: DMS0體積比為3:1的緩沖 溶液溶液發(fā)生明顯的顏色變化，溶液顏色從無色變成淺黃色（圖5)。伴隨著紫外燈下肉眼可 視的硫化氫誘導熒光探針發(fā)出明亮的藍色熒光（圖6)，說明是一種具有生色傳感功能的熒 光探針。
[0026] 實施例5 化合物FN3_H2S熒光探針對細胞外源性硫化氫熒光成像 我們將本發(fā)明探針應用于HeLa細胞中對外源性的硫化氫進行熒光成像應用。具體操作 步驟如下:將5μΜ探針DMS0溶液加入到育有HeLa細胞的培養(yǎng)液(2mL)中在二氧化碳培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)30 min后用共聚焦顯微鏡進行藍通道成像，結果見圖7。首先進行明場成像，可以看到 細胞大致的輪廓（圖7a)。然后用405nm的激光進行激發(fā)成像，探測器接受范圍為425nm-475nm，通過藍通道進行熒光成像可以觀察到在未加入似以前，幾乎觀察不到細胞有熒光發(fā) 射（圖7b)。然而向體系中加入Na 2S 20μΜ的水溶液后，等待30 min后，再用405nm的激光進行 激發(fā)可以觀察到細胞內有明顯的藍光發(fā)出（圖7e)，說明此熒光探針可以對外源性的硫化氫 進行熒光成像。
【主權項】
1. 一種熒光增強型硫化氫分子熒光探針，其特征在于，所述探針分子的分子式為： C21HwN4O2S，其結構式如式（I)所示：2. -種權利要求1所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，它包括以下步 驟： 1) 將Ieq的鄰甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL濃硫酸，加熱回流24小時，然 后分離提純得到化合物1-1;所述化合物1-1結構式如下：2) 將Ieq的化合物1-1，Ieq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加熱回流反應過夜，分 離提純得到化合物1 -2;所述化合物1 -2結構式如下：3) 將Ieq化合物卜2與1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮氣保護，室溫回流反應24小時后，分離 提純得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的結構式如下：4) 將Ieq化合物1-3溶于四氫呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮氣保護，室溫 反應17小時，將反應液用3M鹽酸溶液酸化，然后分離提純得到化合物1-4;所述化合物1-4結 構式如下：5) 將Ieq水楊醛與Ieq鄰氨基苯硫酚，Ieq的Na2S2O5溶解在DMF中，氮氣保護，加熱回流反 應2-3小時，反應完全后，分離提純得到化合物2-1;所述化合物2-1的結構式如下：6)將Ieq化合物2-1與Ieq的化合物1-4, Ieq的DMAP，Ieq的DCC溶于二氯甲烷中，氮氣保 護，室溫反應8小時，分離提純得到目標探針化合物FN3-H2S。3. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中 分離提純方法為:反應液中加入適量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，鹽水洗2-3次，無水硫 酸鈉干燥，然后柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。4. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中 分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。5. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中 分離提純方法為：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗滌2-3次，無水硫酸鈉干燥，柱色譜 分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。6. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中 分離提純方法為：用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，鹽水洗1次，無水硫酸鈉干燥，柱色譜分 離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:2。7. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟5)中 分離提純方法為:反應液倒入大量水中產生固體，然后減壓過濾，真空干燥，得到純產品。8. 根據(jù)權利要求2所述的硫化氫分子熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟6)中 分離提純方法為:柱色譜分離，洗脫劑配比為二氯甲烷:石油醚=1:1。9. 一種權利要求1所述的硫化氫分子熒光探針的應用，其特征在于，所述熒光探針可以 應用于水環(huán)境和生物細胞體系中硫化氫的含量傳感檢測;所述的傳感檢測包含熒光檢測， 目視定性檢測，細胞成像檢測。
【文檔編號】G01N21/64GK105884713SQ201610264719
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】林偉英, 任明光, 鄧貝貝
【申請人】濟南大學