一種從茶多酚中純化茶兒茶素的技術的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從茶多酚中純化茶兒茶素的技術。包括利用硅膠柱層析串聯(lián)低取代度的羥丙基纖維素富集精制茶兒茶素類成分，達到既除去茶多酚中的水溶性和脂溶性色素，又能徹底脫除咖啡堿類成分。層析、富集的填料經(jīng)活化再生后可重復利用，茶兒茶素產(chǎn)品制備過程中所用試劑均具有“綠色”環(huán)保性。
【專利說明】
一種從茶多酚中純化茶兒茶素的技術
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離純化技術領域，具體涉及一種利用硅膠和低取代度羥丙 基纖維素串聯(lián)組合的方式從茶多酚中純化制備茶兒茶素的技術。
【背景技術】
[0002] 茶樹源產(chǎn)于中國云南西雙版納（陳椽.再論茶樹原產(chǎn)地.茶業(yè)通 報，1981，01:20-25.)，隸屬于山茶科（TXeacea)山茶屬（CaazeUia S/neasis (L. ) 0? Ktze.)植物（中國植物志，第49(3)卷）。茶樹所萌發(fā)的新葉可制成一種大眾消費者 喜愛的飲料，在我國有著幾千年的飲用歷史，常飲可以生津止渴、去疾強身和明目益思， 有益身心健康（趙保路.天然抗氧化劑茶多酚的健康作用及其機理.生物物理學報， 2012, 28(5):426-437. |Chung S. Yang. Cancer Prevention by Vitamin E and Tea Polyphenols:Lessons Learned from Studies in Animal Models and humans. Progress in Chemistry, 2013,25 (9):1492-1500.)〇
[0003] 茶葉經(jīng)分離鑒定的化合物約700種（宛曉春.茶葉生物化學，中國農(nóng)業(yè)出版 社，2003)，其中包括茶多酚、有機酸、茶氨酸、生物堿、茶皂素、芳香類物質，等。茶多酚 是茶樹中多酚類混合物，以2-苯基苯并吡喃為主體結構的黃烷醇類化合物一茶兒茶素 占主體成分。茶兒茶素一般包括表型兒茶素（Epicatechin, EC)、表沒食子型兒茶素 (Epigallocatechin, EGC)、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate, ECG)、表沒食子 兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG)，其總質量份數(shù)在干茶中一般高于 7%(w/w).茶兒茶素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤，等特性。
[0004] 我國茶樹資源豐富，實有茶園面積2279. 94千公頃，可采摘有1735. 2千公頃（2012 年度國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)），茶葉產(chǎn)量192. 45萬噸（2013年度國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)）。采摘的茶鮮 葉經(jīng)加工成的干茶一般包括名優(yōu)茶和大宗茶。以浙江省茶產(chǎn)業(yè)為例（毛祖法，羅列萬，陸 德彪，等.浙江省名優(yōu)茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展對策研究.中國茶葉加工，2012, 2:9-12. )，2010 年名優(yōu)茶產(chǎn)量（6. 5萬噸）和產(chǎn)值（84. 4億元）分別是總產(chǎn)量和產(chǎn)值的39. 2%和93. 3%。故 大宗夏秋茶存在產(chǎn)量大、產(chǎn)值低的問題。大宗茶酚氨比高，以深加工手段來開發(fā)利用其中的 多酚將是其發(fā)展途徑之一。據(jù)悉，浙江省當前茶葉深加工企業(yè)約40家，年消耗干茶約8. 2 萬噸，主要用來生產(chǎn)茶多酚、速溶茶，等。茶多酚目前為茶葉深加工企業(yè)的主打產(chǎn)品，其產(chǎn)品 主要運用于茶飲料、食品添加劑及保健類產(chǎn)品。但隨著植物提取物的發(fā)展、生物化學精制純 化技術的進步，及人們對高品質產(chǎn)品不斷追求，成分與功能相對單一、集中的天然產(chǎn)物產(chǎn)品 將是未來一種發(fā)展趨勢。因此，茶兒茶素作為人類的一種健康元素，將其精制純化符合當前 大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0005] 目前市售茶多酚產(chǎn)品主要是利用水提或水的乙醇溶液提取、濃縮干燥而得，粉末 呈黃棕色。茶兒茶素一般得到較好的保留，只是與其相伴隨的雜質較多，尤其是脂溶性與水 溶性色素類成分影響了產(chǎn)品品質。我們實驗室前期收集市場銷售的不同含量規(guī)格的茶多酚 產(chǎn)品，主要來源于浙江東方茶業(yè)科技有限公司、四川禹伽茶業(yè)科技有限公司、晨光生物科技 集團股份有限公司、浙江塔塔茶業(yè)科技有限公司、湖州榮凱植物提取有限公司、福建利康源 生物工程有限公司、江西綠康天然產(chǎn)物有限責任公司、湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司、安 徽紅星藥業(yè)有限責任公司，并按國標家茶葉標準GB/T 8313-2008測定了其所含有的茶多 酸、茶兒茶素成分（見表1)。結果表明，茶兒茶素總量占茶多酸質量百分數(shù)在50 %-88. 8 % 范圍。
[0006] 表1市售茶多酚產(chǎn)品中茶多酚、沒食子酸及茶兒茶素含量（%，w/w)
注：表中樣品中各成分以平均數(shù)土標準偏差（n=3)表不。
[0007] 茶兒茶素的純化方法主要有沉淀法（ZL02139219. 6)、樹脂吸附法（張盛，劉仲 華，黃建安，等.吸附樹脂法制備高純度兒茶素的研究.茶葉科學，2002，22(2): 125-130 | |張盛，劉仲華，黃建安，等.高ECG型兒茶素純化工藝研究.湖南農(nóng)業(yè)大 學學報（自然科學版），2003, 29(2): 144-146. ||龔雨順，劉仲華，黃建安，等.大 孔吸附樹脂分離茶兒茶素和咖啡因研究.湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2005， 31 (1):50-52| |李慧星.樹脂法提取純化兒茶素及兒茶素單體EGCG分離制備的工藝研 究.合肥工業(yè)大學，2006. ||鐘世安，賀國文，涂秋云，等.大孔吸附樹脂對酯型兒茶 素吸附性能的研究.離子交換與吸附，2007，23(5): 392-399. ||仉燕崍.酯型兒茶 素的分離純化工藝研究?大連理工大學，2006 || EP1767097, Process for preparing epigallocatechin gallate||楊性民，劉青梅，高海月，應敏，楊留明.茶多酸中 EGCG分離純化工藝優(yōu)化?中國食品學報，2006，6(5): 77-80. ||王傳金，魏運洋， 朱廣軍，等.聚酰胺色譜法分離制備高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯.應用化學， 2007，24(4): 443-447. ||龔志華，黃甜，龐月蘭，等? HP-20大孔吸附樹脂分離純化 兒茶素 EGCG的效果.湖南農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2010，36(1): 87-90| |jianhan Huang, Kelong Huang, Suqin Liu， Qiong Luo， Mancai Xu. Adsorption properties of tea polyphenols onto three polymeric adsorbents with amide group. Journal of colloid and interface science. ||Ruiying Zhao， Yu Yan， Mingxian Li, Husheng Yan. Selective adsorption of tea polyphenols from aqueous solution of the mixture with caffeine on macroporous crosslinked poly (N-Vinyl-2-pyrrolidinone). Reactive & Functional Polymers 68 (2008) 768-774. | | 楊文漲，趙長青，高杰，等. 用大孔氨甲基聚苯乙烯樹脂選擇性吸附分離荼多酚和咖啡因.離子交換與吸附，2007， 23(6): 481-488. ||唐課文，周春山，鐘世安，等.聚酰胺樹脂對茶多酚和咖啡因吸 附選擇性研究.光譜學與光譜分析，2003，23(1): 143-145.)、反相碳十八填料柱層析 法（周慶秋.天然酯型兒茶素 EGCG的分離純化及藥學研究.黑龍江大學，2008. | |林丹， 李春苗，鮮殊，等.中壓制備液相色譜快速分離制備兒茶素單體.天然產(chǎn)物研究與開 發(fā)，2013, 25(1) :92-95, 100. | |賴榕輝，黃亞輝.中低壓柱層析分離兒茶素的研究.離子 交換與吸附，2012, 28 (2) : 165-170.)、膜分離法（張建勇，江用文，江和源，等.膜分離過 程中兒茶素和咖啡堿含量變化研究.安徽農(nóng)業(yè)科學，2013, 41 (2) :493_496.)、凝膠柱層析 法（黃靜.高純度兒茶素單體EGCG和ECG分離及純化工藝研究.合肥工業(yè)大學，2004)， 等。
[0008] 硅膠作為一種天然無毒性分離材料已廣泛運用于植物提取物中有效成分的分離 與純化，茶多酚的茶兒茶素的制備純化亦不例外（龔正禮，蒲建，劉勤晉.茶葉兒茶素提 取和純化研究.西南農(nóng)業(yè)大學學報，1995, 17 (6) : 546-549 | |楊磊，高彥華，祖元剛，等. 中壓硅膠柱層析連續(xù)純化茶葉中EGCG及ECG的研究.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2007，27(2): 100-104. | |袁華，吳莉，吳元欣，等.硅膠柱層析法提純茶多酚的研究.華中師范大學學 報（自然科學版），2007, 41(4) :553-556.. | |盧濤，蘭先秋，朱斌，等.不同茶多酚中兒 茶素的測定及柱層析法提取EGCG的比較.化工進展，2008, 27(5) : 749-752. | |朱斌，陳 曉光.二次層析制備高純表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG)的工藝研究.食品與機械， 2009，25(4): 83-85.)。發(fā)明人以文獻提供的方法，利用硅膠為柱層析填料對市售茶多酚 中茶兒茶素進行純化驗證實驗。如文獻所述，膠硅以無水乙酸乙酯作為裝柱和洗脫用溶劑， 茶多酚會被分成較為明顯的上下可見的組份，但上下組份中均含有茶兒茶素，分離不徹底； 且被吸附的極性較強色素類成分難以洗脫不容忽視。另一方面，使用后的硅膠需干燥后才 能使用，使得硅膠的特殊的分離性能難以產(chǎn)業(yè)化制備應用。若以凝膠Sephadex LH-20為柱 填料從茶多酚中純化精制茶兒茶素亦存在色素污染難以洗脫的問題，再生洗脫需用高濃度 的強堿和鹽，增加分離周期和實驗難度，從而降低了其產(chǎn)業(yè)化的應用前景。故以現(xiàn)有的工藝 填料作為吸附與層析，獲取高純度的茶兒茶素，有效去除被填料吸附的色素及工藝的組合 優(yōu)化改善顯得尤為必要和緊迫。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種以硅膠和低取代度羥丙基纖維素串聯(lián)組合的方式純 化制備茶兒茶素的技術，具體技術路線見圖1。與現(xiàn)有單獨利用硅膠層析技術相比，該工藝 可以使得茶兒茶素更加有效的分離和富集。
[0010] 本發(fā)明的目的還在于提供一種有效去除被硅膠吸附后的完固性色素，吸附層析后 的硅膠活化更加簡單可行，從而可以實現(xiàn)長期循環(huán)利用。本發(fā)明提供的一種從茶多酚中純 化茶兒茶素的技術，包括： (1) 將茶多酚粉末用含醋酸的水溶解，得茶多酚溶液； (2) 離心步驟（1)所配制的茶多酚溶液，獲得上清液； (3) 將步驟（2)的上清液與水飽和的乙酸乙酯充分混合，待分層后，獲取上層酯相萃取 液； (4) 濃縮步驟（3)的上層酯相萃取液，獲得濃縮液； (5) 將步驟（4)的濃縮液上樣于硅膠層析柱； (6) 以水飽和乙酸乙酯洗脫，并收集洗脫液； (7) 濃縮步驟（6)的洗脫液，以去除乙酸乙酯，得茶兒茶素純化產(chǎn)物（I); (8) 利用酒石酸鉀鈉水溶液洗脫再生步驟（5)中的硅膠； (9) 用水稀釋步驟（7)中的茶兒茶素純化產(chǎn)物（I)，獲得水溶液； (10) 將步驟（9)的水溶液上樣并吸附于低取代度羥丙基纖維素； (11) 用水洗脫； (12) 用15-45 % (v/v)的乙醇洗脫，并收集洗脫液； (13) 濃縮步驟（12)的洗脫液，獲得濃縮液； (14) 利用含乙酸乙酯的水洗脫再生步驟（10)中的低取代度羥丙基纖維素； (15) 向步驟（13)的濃縮液中加入乙酸乙酯充分混合，待分層后，獲取上層酯相萃取 液； (16) 濃縮步驟（15)的上層酯相萃取液，以去除乙酸乙酯，得茶兒茶素純化產(chǎn)物（II); (17) 進一步真空干燥步驟（16)的茶兒茶素純化產(chǎn)物（II)，得精制純化的茶兒茶素。
[0011] 優(yōu)先地，其中步驟（1)所述含有醋酸的水，醋酸濃度在1-4 mol/L。
[0012] 優(yōu)先地，其中步驟（1)所述含有醋酸的水，醋酸濃度為2 mol/L。
[0013] 優(yōu)先地，其中步驟（1)所述的茶多酚溶液，茶多酚濃度高于5 % (w/v)。
[0014] 優(yōu)先地，其中步驟（1)所述的茶多酚溶液，茶多酚濃度為10 % (w/v)。
[0015] 優(yōu)先地，其中步驟（2)所述的離心機轉速彡3000 r/min。
[0016] 優(yōu)先地，其中步驟（2)所述的離心時間彡10 min。
[0017] 優(yōu)先地，其中步驟（3)所述的水飽和乙酸乙酯為上清液的0. 5-1. 5倍體積。
[0018] 優(yōu)先地，其中步驟（3)所述水飽和的乙酸乙酯為上清液的1倍。
[0019] 優(yōu)先地，其中步驟（3)所述水飽和的乙酸乙酯為上清液的1倍，萃取2次。
[0020] 優(yōu)先地，其中步驟（4)、（7)、（13)、（16)和（17)在真空度-0.07 MPa ~ 1 MPa，溫度35 °C ~ 50 °C條件下進行。
[0021] 優(yōu)先地，其中步驟（9)中溶液的濃度控制在0.5 % ~ 5 %(w/v)。
[0022] 優(yōu)先地，其中步驟（11)洗脫殘留的醋酸。
[0023] 優(yōu)先地，其中步驟（8)的酒石酸鉀鈉的濃度為35 mmol/L ~ 50 mmol/L。
[0024] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于： (1)未經(jīng)純化的茶多酚（茶多酚含量一般低于80 %，w/w)以常溫水溶解會有一部分黏 性成分難以溶解，難溶解的成分會吸附一定量的茶兒茶素共同形成沉淀；如以一定濃度的 醋酸溶解茶多酚，則會促使沉淀中的茶兒茶素重新溶解于水中，從而降低茶兒茶素的損失。
[0025] (2)硅膠柱吸附層析前通過水飽和乙酸乙酯萃取，一方面富集了茶兒茶素，另一方 面降低了水溶性色素成分與硅膠層析填料發(fā)生過度的吸附作用。
[0026] (3)水裝填硅膠，充分活化后，再以水飽和乙酸乙酯平衡，并以此作為柱層析洗脫 劑，則可使咖啡堿和水溶性強的色素得以強保留吸附，而茶兒茶素和脂溶性較強的黃紅色 色素隨洗脫劑一齊洗脫，從而實現(xiàn)較充分的第一步層析純化。
[0027] (4)硅膠層析柱的活化再生直接采用酒石酸鉀鈉的水溶液，便于水飽和乙酸乙酯 的平衡再利用，從而簡易實現(xiàn)柱層析填料的可重復循環(huán)利用的目的。
【附圖說明】
[0028] 圖1是從茶多酚中純化茶兒茶素技術路線示意圖。
[0029] 圖2是茶多酚原料、硅膠柱層析水飽和乙酸乙酯洗脫液、低取代羥丙基纖維素水 洗脫液及解析液中各成分（沒食子酸、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶 素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯）的HPLC圖譜。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例，更進一步闡述本發(fā)明的主旨。
[0031] 下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 下述實施例中茶兒茶素的分析均采用國標方法（GB/T 8313-2008,茶葉中茶多酚 和兒茶素類含量的檢測方法）。高效液相色譜Waters (1525栗、柱溫箱、2487紫外可見雙 通道檢測器、717-plus自動進樣器、價⑶從控制軟件包），色譜柱為Phenomenex Luna 5 Mm Phenyl-Hexyl, 250 mm X 4. 6 mm。采用咖啡堿作為內標系數(shù)法定量各成分。分別取咖啡 堿標準溶液50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L進樣10 ML，經(jīng)高效液相色譜分離后，在278 nm條 件下所對應的積峰面積分別為 1311154 (PV X Sec) ,2671194 (PV X Sec) ,4058875 (PV X Sec);強制經(jīng)過坐標軸原點的標準曲線為M峰面積）=26900 X x (濃度mg/L)，R2 = 0.999。
[0033] 下述實施例中所述的茶多酚為同一批次，茶多酚原料、硅膠柱層析制備的茶兒茶 素粗品、低取代羥丙基纖維素水洗脫液及解析液中各成分的HPLC圖如圖2所示。所述的 GA、EGC、CAF、EC、EGCG、ECG分別為沒食子酸、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子 兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯。所述的L-HPC為低取代度羥丙基纖維素。
[0034] 下述實驗例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0035] 下述實施例中實驗數(shù)據(jù)的采集在2014年10月至2014年12月完成。
[0036] 實施例1純水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置于10mL塑料刻度管中，并加5 mL的純水，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。稀釋50倍后，進10 ML進行高效 液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干燥5 h后取出精密稱量。結果表 明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為164. 2 mg/L，ECG的濃度為22. 2 mg/L，沉淀重0. 1088 g°
[0037] 實施例2含醋酸的水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置10 mL塑料刻度管中，并加5 mL的醋酸水溶液（醋酸濃度為 0. 2 mol/L)，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。 稀釋50倍后，進10 ML進行高效液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干 燥5 h后取出精密稱量。結果表明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為189. 8 mg/L，ECG的 濃度為22.9 mg/L，沉淀重0.0901 g。
[0038] 實施例3含醋酸的水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置10 mL塑料刻度管中，并加5mL的醋酸水溶液（醋酸濃度為 0.5 mol/L)，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。 稀釋50倍后，進10 ML進行高效液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干 燥5 h后取出精密稱量。結果表明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為206. 2 mg/L，ECG的 濃度為29.5 mg/L，沉淀重0.0735 g。
[0039] 實施例4含醋酸的水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置10 mL塑料刻度管中，并加5mL的醋酸水溶液（醋酸濃度為1 mol/L)，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。稀釋 50倍后，進10 ML進行高效液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干燥5h 后取出精密稱量。結果表明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為253. 4 mg/L，ECG的濃度為 37. 1 mg/L，沉淀重 0.0427 g。
[0040] 實施例5含醋酸的水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置10 mL塑料刻度管中，并加5 mL的醋酸水溶液（醋酸濃度為 2 mol/L)，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。稀 釋50倍后，進10 ML進行高效液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干燥 5 h后取出精密稱量。結果表明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為258.8 mg/L，ECG的濃 度為 37.6 mg/L，沉淀重 0.025 g。
[0041] 實施例6含醋酸的水溶解茶多酚粉末 取茶多酚粉末〇. 5 g置10 mL塑料刻度管中，并加5 mL的醋酸水溶液（醋酸濃度為 4 mol/L)，充分攪拌并經(jīng)3500 r/min離心10 min后，轉移上清至10 mL容量瓶中定容。稀 釋50倍后，進10 ML進行高效液相色譜分析。塑料刻度管中的沉淀經(jīng)80 °C熱風充分干燥 5 h后取出精密稱量。結果表明，經(jīng)定容的上清液中EGCG的濃度為267. 5 mg/L，ECG的濃 度為 40.8 mg/L，沉淀重 0.012 g。
[0042] 上述實施例中，對照取20 mg茶多酸以50 % (v/v)乙醇完全溶解定溶于10 mL，進 10 ML進行高效液相色譜分析。結果表明，經(jīng)定容的溶液中GA、EGC、CAF、EC、EGCG和ECG的 濃度分別為 11.9 mg/L，68.6 mg/L，97.1 mg/L，17.8 mg/L，100.2 mg/L，23.7 mg/L。茶多 酚原料中各成分GA、EGC、CAF、EC、EGCG和ECG的質量份數(shù)分別為0. 6 %、3. 4 %、4. 8 %、0. 9 %、5.0 %、1.2 %〇
[0043] 實施例7硅膠柱層析純化富集茶兒茶素 以市售茶多酸粉末5 g為一純化富集單元，每單元所采用的步驟如下： ①準確稱取茶多酸粉末5 g，加入2 mol/L的醋酸水50 mL，充分攪拌后，放入離心機中 3500 r/min離心10 min后，取上清并加入25 mL水飽和乙酸乙酯，充分震搖并靜置分層后， 取上層酯相上樣于水飽和乙酸乙酯平衡的硅膠層析柱（約200目硅膠100 g，柱徑3.5 cm， 柱高26 cm，柱床中的間隙體積80 mL)，并以水飽和乙酸乙酯洗脫，收集始于洗脫液含有黃 紅色色素至洗脫液無色為止。濃縮洗脫液至干后，真空干燥得茶兒茶素粗品0.42 g。
[0044] ②準確稱取茶多酚粉末5 g，加入2 mol/L的醋酸水50 mL，充分攪拌后，放入離心 機中3500 r/min離心10 min后，取上清并加入50 mL水飽和乙酸乙酯，充分震搖并靜置分 層后，取上層酯相上樣于水飽和乙酸乙酯平衡的硅膠層析柱（約200目硅膠100 g，柱徑3. 5 cm，柱高26 cm，柱床中的間隙體積80 mL)，并以水飽和乙酸乙酯洗脫，收集始于洗脫液含有 黃紅色色素至洗脫液無色為止。濃縮洗脫液至干后，真空干燥得茶兒茶素粗品0. 53g。
[0045] ③準確稱取茶多酚粉末5 g，加入2 mol/L的醋酸水50 mL，充分攪拌后，放入離心 機中3500 r/min離心10 min后，取上清并加入150 mL水飽和乙酸乙酯，充分震搖并靜置 分層后，取上層酯相并濃縮至其體積低于100 mL ;取濃縮液上樣于水飽和乙酸乙酯平衡的 硅膠層析柱（約200目硅膠100 g，柱徑3. 5 cm，柱高26 cm，柱床中的間隙體積80 mL)，并 以水飽和乙酸乙酯洗脫，收集始于洗脫液含有黃紅色色素至洗脫液無色為止。濃縮洗脫液 至干后，真空干燥得茶兒茶素粗品0.57 g。
[0046] 合并混合以上①②③單元所得的茶兒茶素粗品（茶兒茶素純化產(chǎn)物（I))為1. 52 g。經(jīng)HPLC檢測其所含有的GA、EGC、EC、EGCG和ECG的質量份數(shù)（％，w/w)分別為2. 3 %、 4. 1 %、4.9 %、34. 0 %、9.1 %。采用酒石酸鉀鈉的水溶液洗脫再生硅膠。
[0047] 實施例8 L-HPC吸附柱富集茶兒茶素 取實施例7所得茶兒茶素粗品0. 5 g溶解于并定容至100 mL，以1 cm/min的流速上 樣于水平衡的1-即(：（5 8 1-即(：，柱徑1.6(^，柱高13.5(^，柱床中的間隙體積1〇1^)， 并以30 % (v/v)乙醇水溶液進行洗脫，同時收集洗脫液。觀察發(fā)現(xiàn)，洗脫液為淺淡黃色，且 L-HPC吸附的深紅色色素未被洗脫。將洗脫液真空進行濃縮揮去乙醇后，利用乙酸乙酯進行 富集干燥得精制茶兒茶素產(chǎn)物〇. 25 g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的質量份數(shù)（％，w/w) 分別為3.2%、4.5%、7.7%、59.5%、13.0%。
[0048] 實施例9 L-HPC吸附柱富集茶兒茶素 取實施例7所得茶兒茶素粗品0. 5 g溶解于并定容至100 mL，以1 cm/min的流速上 樣于水平衡的1-即(：（5 8 1-即(：，柱徑1.6(^，柱高13.5(^，柱床中的間隙體積1〇1^)， 并以40 % (v/v)乙醇水溶液進行洗脫，同時收集洗脫液。觀察發(fā)現(xiàn)，洗脫液為淡黃色，且 L-HPC吸附的深紅色色素未被洗脫。將洗脫液真空進行濃縮揮去乙醇后，利用乙酸乙酯進行 富集干燥得精制茶兒茶素產(chǎn)物〇. 27 g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的質量份數(shù)（％，w/w) 分別為3.7%、6.5%、7.9%、56.8%、16.0%。
[0049] 實施例10 L-HPC吸附柱富集茶兒茶素 取實施例7所得茶兒茶素粗品0. 5 g溶解于并定容至100 mL，以1 cm/min的流速上 樣于水平衡的1-即(：（5 8 1-即(：，柱徑1.6(^，柱高13.5(^，柱床中的間隙體積1〇1^)， 并以50 % (v/v)乙醇水溶液進行洗脫，同時收集洗脫液。觀察發(fā)現(xiàn)，洗脫液為淡黃色，且 L-HPC吸附的深紅色色素未被洗脫。將洗脫液真空進行濃縮揮去乙醇后，利用乙酸乙酯進行 富集干燥得精制茶兒茶素產(chǎn)物〇. 31 g，其中GA、EGC、EC、EGCG和ECG的質量份數(shù)（％，w/w) 分別為3.8%、6.6%、7.6%、52.8%、16.5%。
【主權項】
1. 一種從茶多酚中純化茶兒茶素的技術，包括： (1) 將茶多酚粉末用含醋酸的水溶解，得茶多酚溶液； (2) 離心步驟（1)所配制的茶多酚溶液，獲得上清液； (3) 將步驟（2)的上清液與水飽和的乙酸乙酯充分混合，待分層后，獲取上層酯相萃取 液； (4) 濃縮步驟（3)的上層酯相萃取液，獲得濃縮液； (5) 將步驟（4)的濃縮液上樣于硅膠層析柱； (6) 以水飽和乙酸乙酯洗脫，并收集洗脫液； (7) 濃縮步驟（6)的洗脫液，以去除乙酸乙酯，得茶兒茶素純化產(chǎn)物（I); (8) 利用酒石酸鉀鈉水溶液洗脫再生步驟（5)中的硅膠； (9) 用水稀釋步驟（7)中的茶兒茶素純化產(chǎn)物（I)，獲得水溶液； (10) 將步驟（9)的水溶液上樣并吸附于低取代度羥丙基纖維素； (11) 用水洗脫； (12) 用15-45 % (v/v)的乙醇洗脫，并收集洗脫液； (13) 濃縮步驟（12)的洗脫液，獲得濃縮液； (14) 利用含乙酸乙酯的水洗脫再生步驟（10)中的低取代度羥丙基纖維素； (15) 向步驟（13)的濃縮液中加入乙酸乙酯充分混合，待分層后，獲取上層酯相萃取 液； (16) 濃縮步驟（15)的上層酯相萃取液，以去除乙酸乙酯，得茶兒茶素純化產(chǎn)物（II); (17) 進一步真空干燥步驟（16)的茶兒茶素純化產(chǎn)物（II)，得精制純化的茶兒茶素。2. 如權利要求1所述的技術，其中步驟⑴所述含有醋酸的水，醋酸濃度在1-4 mol/ L〇3. 如權利要求2所述的技術，其中步驟（1)所述含有醋酸的水，醋酸濃度為2 mol/L。4. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（1)所述的茶多酚溶液，茶多酚濃度高于5 % (w/v)〇5. 如權利要求4所述的技術，其中步驟（1)所述的茶多酚溶液，茶多酚濃度為10 % (w/ v) 〇6. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（2)所述的離心機轉速多3000 r/min。7. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（2)所述的離心時間多10 min。8. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（3)所述的水飽和乙酸乙酯為上清液的 0. 5-1. 5倍體積。9. 如權利要求8所述的技術，其中步驟（3)所述水飽和的乙酸乙酯為上清液的1倍。10. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（3)所述水飽和的乙酸乙酯為上清液的1倍， 萃取2次。11. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（4)、（7)、（13)、（16)和（17)在真空 度-0.07 MPa ~ -0· 1 MPa，溫度 35 °C ~ 50 °C條件下進行。12. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（9)中溶液的濃度控制在0.5 % ~ 5 %(w/v)。13. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（11)洗脫殘留的醋酸。14. 如權利要求1所述的技術，其中步驟（8)的酒石酸鉀鈉的濃度為35 mmol/L ~ 50 mmol/Lo15.如權利要求1所述的技術，其中步驟（1)所用的荼多酚來源于綠荼或烏龍荼。
【文檔編號】C07D311/62GK105820148SQ201510001063
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月5日
【發(fā)明人】涂云飛, 張士康, 楊秀芳, 朱躍進, 譚蓉, 王靜
【申請人】中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究所