檢測遺傳變體的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及遺傳變體的檢測，包括用于檢測遺傳變體的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 群體中個體之間的遺傳變異通常通過在一些情況下表現(xiàn)為疾病或障礙的表型改 變而觀察。有些情況下，疾病或障礙僅表現(xiàn)為對外部刺激諸如藥物或其他化學品的不良反 應。通過遺傳檢測進行藥物不良反應(ADR)與患者遺傳組成的關聯(lián)研究有希望大大降低與 ADR相關的發(fā)病率和死亡率。在ADR與遺傳變體之間存在若干已知的聯(lián)系。
[0003] 氣尿喀晚（5-FU)已被用作治療乳腺癌、結直腸癌、肺癌和其他癌癥患者的化療劑 達數(shù)十年。5-即的副作用包括腹瀉、口腔炎、粘膜炎、神經(jīng)毒性，并在一些情況下，包括死亡。 運些副作用主要是因為在遺傳學上不能代謝該藥物。二氨喀晚脫氨酶(DPDK-種由DH)基 因編碼的酶）負責消除約80%標準劑量的5-FU。由于DTO基因突變導致的Dro缺乏已與嚴重 的5-即毒性相關聯(lián)。已發(fā)現(xiàn)，約3-5 %的患者具有至少部分DTO缺乏。與Dro缺乏相關的最常 見突變是IVS14+1G〉A，其為在內(nèi)含子14(稱為DPD*2A)的剪接識別序列處發(fā)生的G〉A堿基改 變。該單核巧酸變異導致外顯子跳讀，并在DPD mRNA中產(chǎn)生165-bp的缺失。純合子DPD*2A基 因型導致完全缺乏，而雜合的DPD*2A基因型導致DTO的部分缺乏。該代謝功能障礙的治療前 檢測可通過施用替代性處理而預防嚴重的5-RJ副作用。
[0004] 類似地，已報道了在用氯化格雷治療的急性冠狀動脈綜合征(ACS)患者尤其是接 受經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)的那些患者之中CYP2G19基因型與臨床預后的聯(lián)系。氯化格雷是 一種經(jīng)常出現(xiàn)在處方中的口服抗血小板劑，其用于在冠狀動脈疾病、外周血管疾病和腦血 管疾病中抑制血塊。作為嚷吩并化晚前藥，氯化格雷需要肝臟生物轉化W形成活性代謝物。 肝CYP2C19酶是在參與氯化格雷代謝的CYP450超家族中的一種酶。CYP2C19基因是高度多態(tài) 性的，具有超過25種已知的變體等位基因。最常見的CYP2C19功能喪失性等位基因是 CYP2C19*2(c.681G〉A;rs4244285)，等位基因頻率在高加索人和非洲人中為約15%，在亞洲 人中為29-35%。然而，當前針對功能喪失的遺傳檢測方法通常需要昂貴的儀器和長周轉時 間。
[0005] 另一個實例是發(fā)現(xiàn)卡馬西平引起的斯-瓊綜合征/中毒性表皮壞死松解癥（SJS/ TEN)與人白細胞抗原化LA)特定等位基因HLA-B*1502的密切聯(lián)系?？R西平是用于治療患 有癒痛、神經(jīng)性疼痛和雙相情感障礙的一線藥物。然而，卡馬西平治療可導致危險的或甚至 致命性的皮膚反應，諸如在具有HLA-B*1502等位變異的患者中的SJS和TENdHLA-B*1502等 位基因在亞洲人群（日本人和韓國人除外）中的出現(xiàn)率遠高于在高加索人和非洲人群中的 出現(xiàn)率。一些研究掲示:對卡馬西平引起的SJS進行的HLA-B*1502檢測的陰性預測值可接近 100% "HLA-B基因是高度多態(tài)性的，具有超過2000個獨特的等位基因，運使得特定等位基因 的測定復雜化。Sanger測序被視為HLA分型的金標準。然而，相位多值性(ambigui ty)在等位 基因組合的鑒定中經(jīng)常導致SBT存在問題。下一代測序(NGS)技術能夠獲得單個DNA分子的 序列，并可排除相位多值性，但當前NGS方法的缺點包括讀取長度短、文庫制備工作量高和 處理時間長。最近的報道將環(huán)介導等溫擴增化AMP)用于HLA-B*1502篩查（Cheng，et al.Clin.Chem. 2009，55，1568.)。遺憾的是，運些方法的特異性不足W將HLA-B*1502與相當 多的在一些群體中不稀有的其他等位基因區(qū)分開來。錯誤的測定會將SJS風險極低的患者 從有效的卡馬西平療法中排除，并增加治療成本。由于HLA-B*1502篩查的成本效益高度依 賴于遺傳檢測的準確性和成本，因此迫切需要特異性更高且成本更低的新測定法。
[0006] 美國食品藥品監(jiān)督管理局(抑A)和其他監(jiān)管機構已要求對若干在某些基因型中可 能具有副作用的藥物在標簽上注明。例如，對基于氣尿喀晚(5-即)的藥物的要求是要包括 在一些個體中發(fā)生超敏反應的警告。又如，美國食品藥品監(jiān)督管理局在2007年發(fā)出警示:建 議在用卡馬西平開始治療其祖先來自存在特定等位基因的地區(qū)的患者之前對HLA-B*1502 等位基因進行篩查。類似地，卡馬西平標簽上的黑框警告建議在具有ACS或PCI的弱代謝者 中考慮使用替代抗血小板療法。
[0007] 對于一些遺傳變體而言，可W得到用于基因分型檢測的商業(yè)試劑盒，將運些試劑 盒用于預測個體對藥物是否耐受。所用的試驗平臺包括Sanger測序和限制性片段長度多態(tài) 性(RFLP)分析。基于運些平臺的測定法要么耗時要么昂貴，因此不太適于按需檢測。也可W 獲得基于實時PCR的商業(yè)試劑盒，遺憾的是，運些方法的特異性不足W將復雜的等位變體與 相當多的在一些群體中不稀有的其他等位基因區(qū)分開來。由于篩查的成本效益高度依賴于 遺傳檢測的準確性和成本，因此迫切需要特異性更高且成本更低的新測定法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明通過在本發(fā)明第一方面中提供一種檢測與疾病或障礙包括與藥物不相容 性相關的遺傳變體的方法而滿足此需求，該方法包括W下步驟：
[0009] a)提供偶合到至少一個嗎嘟代核酸探針的第一納米粒子，該探針包含祀互補區(qū)， 所述祀互補區(qū)含有與遺傳變體完全匹配的堿基序列；
[0010] b)在允許嗎嘟代核酸探針和疑似含有遺傳變體的核酸雜交的條件下將包含疑似 含有遺傳變體的核酸的樣品與第一納米粒子合并W提供第一混合物；
[0011] C)依序加熱第一混合物并測定嗎嘟代核酸探針與疑似含有遺傳變體的核酸之間 的雜交復合物的解鏈溫度；
[0012] d)將步驟C)中測定的解鏈溫度與標準進行比較W確定樣品是否包含含有遺傳變 體的核酸。
[0013] 本發(fā)明的另一個方面設及一種用于執(zhí)行本文所述的方法的檢測試劑盒，該試劑盒 包含:偶合到至少一個嗎嘟代核酸探針的第一納米粒子，該探針包含祀互補區(qū)，所述祀互補 區(qū)含有與遺傳變體序列完全匹配的堿基序列，遺傳變體序列與疾病或障礙包括與藥物不相 容性相關。
[0014] 參照W下附圖和對多種非限制性實施方案的描述，本發(fā)明的其他方面對本領域的 技術人員將顯而易見。
【附圖說明】
[0015] 附圖未必按比例繪制，相反，重點通常在于闡述多種實施方案的原理。在W下描述 中，參照W下附圖描述本發(fā)明的多種實施方案。
[0016] 圖I.用于DTO測試的MOR的序列。每對探針的單堿基差異帶有下劃線。
[0017] 圖2.用于DPD基因型分析的合成DNA樣品的序列。單核巧酸多態(tài)性(SNP)位置帶有 下劃線。
[001引圖3.用于DPD祀序列擴增的PCR引物。
[0019] 圖4.用于DPD序列PCR擴增的熱循環(huán)儀方案。
[0020] 圖5.隨著祀向DPD*2A SNP的(a)WT和(b)MUT探針的DPD祀濃度而變化的解鏈溫度。 樣品為合成的單鏈野生型DNA(圓形）、突變型DNA(方形)及其1:1混合物(S角形，代表雜合 子樣品）DTm測量誤差=± TC。
[0021] 圖6.DPD合成DNA樣品的Tm"和TmMUT的散點圖。Tm測量誤差=± rc。
[0022] 圖7.典型HLA-B等位基因的比對。
[0023] 圖8.用于HLA-B* 1502等位基因測定的PCR引物和探針設計。
[0024] 圖9. PCRl的HLA-B等位基因中的組合多值性(ambiguitieS)。
[002引圖10.用于HLA-B測試的MOR的序列。
[0026] 圖11.用于HLA-B基因型分析的合成DNA樣品的序列。核巧酸變體通過下劃線突出 顯示。
[0027] 圖13.用于HLA-B測試的PCR引物的序列。
[002引圖14.用于HLA-B序列PCR擴增的熱循環(huán)儀方案。
[0029] 圖15.隨著用于HLA-B測試的納米探針1、2和3的祀濃度而變化的解鏈溫度。
[0030] 圖16.用于CYP2C19測試的MOR的序列。單堿基差異通過下劃線突出顯示。
[00川圖17.隨著祀向CYP2C19*2SNP的(a)WT和(b)MUT探針的祀濃度而變化的解鏈溫度。 樣品為合成的單鏈野生型DNA(圓形）、突變型DNA(方形)及其1:1混合物(S角形，代表雜合 子樣品）DTm測量誤差=± TC。
[0032] 圖18.用于本研究的CYP2C19合成DNA樣品的序列。SNP位置通過下劃線突出顯示。
[00削圖19.CYP2C19合成DNA樣品的Tm"和Tm*T的散點圖。Tm測量誤差=± TC。
[0034] 圖20.用于CYP2C19祀序列擴增的PCR引物。
[00巧]圖21.用于CYP2C19PCR擴增的熱循環(huán)儀方案。
【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明人開發(fā)了一種經(jīng)濟有效的使用偶合到特定嗎嘟代寡核巧酸序列的納米探 針的基因分型平臺。相應的測定試劑盒可大大促進藥物基因組學知識在臨床實踐中的轉 化。
[0037] 本發(fā)明的第一方面設及一種檢測與疾病或障礙包括與藥物不相容性相關的遺傳 變體的方法，該方法包括W下步驟：
[0038] a)提供偶合到至少一個嗎嘟代核酸探針的第一納米粒子，該探針包含祀互補區(qū)， 所述祀互補區(qū)含有與遺傳變體完全匹配的堿基序列；
[0039] b)在允許嗎嘟代核酸探針和疑似含有遺傳變體的核酸雜交的條件下將包含疑似 含有遺傳變體的核酸的樣品與第一納米粒子合并W提供第一混合物；
[0040] C)依序加熱第一混合物并測定嗎嘟代核酸探針與疑似含有遺傳變體的核酸之間 的雜交復合物的解鏈溫度；
[0041] d)將步驟c)中測定的解鏈溫度與標準進行比較W確定樣品是否包含含有遺傳變 體的核酸。
[0042] 如本文所用的術語"遺傳變體(genetic variant)"是指不同于群體的優(yōu)勢基因型 的天然存在的基因序列，其導致與疾病或障礙相關的表型變化，包括與藥物不相容性。優(yōu)勢 基因型可定義為存在于大部分群體中的序列或最常見的基因型。在多種實施方案中，優(yōu)勢 基因型包括在至少55 %的群體中、或至少60 %、或至少70 %、或至少80%、或至少90%、或至 少95%的群體中相同的基因序列。在本文中，術語"優(yōu)勢基因型"也稱為"野生型"。因此，野 生型或優(yōu)勢序列不包括導致疾病或障礙的遺傳變異。遺傳變體的實例包括核酸缺失、核酸 添加、單核巧酸多態(tài)性(SNP)或等位變體。如本文所用的術語"遺傳變體"因此意指給定基因 的堿基序列中的特定變異。
[0043] 本發(fā)明的嗎嘟代核酸為二氨基憐酸嗎嘟代寡核巧酸(PMO)，其中糖和憐酸骨架被 氨基憐酸連接的嗎嘟基團取代，并且諸如胞喀晚、鳥嚷嶺、腺嚷嶺、胸腺喀晚和尿喀晚，優(yōu)選 腺嚷嶺、鳥嚷嶺、胞喀晚和胸腺喀晚的核堿基偶合到嗎嘟環(huán)。PMO通常包括W下結構的單體 單元-
[0044
[0045] 術語"嗎嘟代(mo巧holino)"、"嗎嘟代核酸"和"嗎嘟代(寡)核巧酸"在本文可互換 使用，并指代上述二氨基憐酸嗎嘟代寡核巧酸(PMO)。
[0046] 在多種實施方案中，嗎嘟代寡核巧酸共價偶合到納米粒子。運可W例如經(jīng)由5'-端 氨基憐酸基團或3'-端環(huán)氮而實現(xiàn)。本文所述的嗎嘟代寡核巧酸的長度可包括約5個單體單 元至約40個單體單元、約10個單體單元至約35個單體單元或約15個單體單元至約35個單體 單元。