膚的DNA，使之融合到核巧酸序列的上游。已知用于葉綠體的許多 運種祀序列，并且已知證明了它們在異源構(gòu)建中的功能。本發(fā)明核巧酸序列的表達(dá)也可祀 向到宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡中。實現(xiàn)上述運些目的的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0097] 可用于植物轉(zhuǎn)化的大量轉(zhuǎn)化載體是植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且本發(fā)明的 核酸分子可W與任何運種載體聯(lián)合使用。載體的選擇將依賴于用于轉(zhuǎn)化的優(yōu)選轉(zhuǎn)化技術(shù)和 祀植物物種。對于一些祀物種，可W優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇性標(biāo)記。通常用在轉(zhuǎn)化 中的選擇性標(biāo)記包括賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因（Messing&Vierra.， 1982. Gene 19: 259-268;和Bevan等，1983.化ture 304:184-187)，賦予對除草劑麟絲菌素 抗性的 bar 基因 ，（White 等，1990.Nucl.Acids Res 18: 1062,和 Spencer 等， 1990. Theor. Appl. Genet 79:625-631)，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因（Blochinger& Diggelmann,Mol Cell Biol 4:2929-2931)，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因 (Bourouis等，1983.EMBO J. 2(7) :1099-1104)，賦予對草甘憐抗性的EPSPS基因化.S.專利 號:4，940，935和5，188，642)，和提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸異構(gòu)酶基因（美國專 利號5,767,378和5,994,629)。然而，選擇性標(biāo)記的選擇對本發(fā)明不是至關(guān)重要的。
[0098] 在另一個優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明的核巧酸序列直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。 質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點是質(zhì)體通常不需要實質(zhì)修飾就能表達(dá)細(xì)菌基因，并且質(zhì)體能表達(dá)單啟 動子控制下的多個開放讀框。在美國專利5，451，513、5，545，817和5，545，818中，PCT申請?zhí)?W0 95/16783中和Me化ide等，（1994)Proc.化ti .Acad. Sci .USA 91,7301-7305中詳盡地描 述了質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括例如利用生物轟擊或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如 氯化巧或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)將位于目的基因和選擇標(biāo)記側(cè)翼的克隆質(zhì)體DNA的區(qū)域一起引入 適合的祀組織中。1到1.化b側(cè)翼區(qū)域，稱為導(dǎo)向序列，可促進(jìn)與質(zhì)體基因組的同源重組，因 此允許原質(zhì)體系特定區(qū)域的置換或修飾。最初，可利用在提供了對壯觀霉素和/或鏈霉素抗 性的葉綠體16S rRNA和巧S12基因的點突變作為轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(Svab, Z.,化jd址iewiCZ， P.，和Maiiga，P.(1990)Proc.化ti. Acad.Sci. USA 87，8526-8530;Staub，J. Μ.，和Maiiga， P.(1992)Plant Cell 4,39-45)。運W約每100次祀葉片轟擊1次的頻率產(chǎn)生了穩(wěn)定的同質(zhì) 轉(zhuǎn)化體。運些標(biāo)記間存在的克隆位點可W用來產(chǎn)生用于導(dǎo)入外源基因的質(zhì)體祀向載體 (Staub，J.Μ.，和Mai iga，P. (1993化MB0 J. 12，601 -606)。通過用顯性選擇標(biāo)記，編碼壯觀霉 素去毒酶（spectinomycin-cletoxifying enzyme)氨基糖巧類-3'-腺巧酷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌 aadA基因置換隱性rRNA或r-蛋白質(zhì)抗生素抗性基因可獲得轉(zhuǎn)化頻率的顯著增加（Svab，Z. 和]?曰11邑日，？.（1993化'〇。.船扣.4。日(1.5(^.1]54 90,913-917)。^前，該標(biāo)記成功地用于高頻 率轉(zhuǎn)化綠藻化lamydomonasreinhardtii質(zhì)體基因組（Goldschmidt-Cle;rmont,M.(1991) Nucl .Acids Res. 19:4083-4089)。其它用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，并且包 含在本發(fā)明范圍內(nèi)。通常，轉(zhuǎn)化后需要約15到20個細(xì)胞分裂周期W達(dá)到同質(zhì)狀態(tài)。通過同源 重組將基因插入每個植物細(xì)胞中存在的所有幾千個環(huán)形質(zhì)體基因組拷貝中的質(zhì)體表達(dá)利 用了拷貝數(shù)大大高于核表達(dá)基因的優(yōu)勢，使得表達(dá)水平可W容易地超過總可溶植物蛋白質(zhì) 的10%。在優(yōu)選實施方式中，將本發(fā)明核巧酸序列插入到質(zhì)體祀向載體中，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)入期 望的植物宿主質(zhì)體基因組中。獲得了對于含有本發(fā)明核巧酸序列的質(zhì)體基因組而言屬同質(zhì) 的植物，優(yōu)選地，該植物具有高水平地表達(dá)核巧酸序列的能力。
[0099] MS培養(yǎng)基的成分見表2，1/2MS培養(yǎng)基組分為表2的一半。
[0100] 表2MS培養(yǎng)基成分
[0101]
[0102] 載體pCanG-Myc(植物二元表達(dá)載體）：改造自pCambial300-221(參考文獻(xiàn):Yiyue Zhang,Chengwei Yang, Yin Li,Nuoyan Zheng,Hao Chen ,Qingzhen Zhao,Ting Gao , Huishan Guo and Qi Xie(2007)SDIRlIs a RING Finger E3Ligase That Positively Regulates Stress-Responsive Abscisic Acid Signaling in Arabidopsis.Plant Cell. 19(6): 1912-1929);將6 XMyc序列(序列3)替換pCambial300-221 載體的Kpnl和Xball 位點間的GUS基因得到的載體，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供。
[0103] 根癌上壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens化HA105株：參考文獻(xiàn)：Yiyue Zhang, Chengwei Yang,Yin Li,Nuoyan Zheng,Hao Chen,Qingzhen Zhao,Ting Gao,Huishan Guo and Qi Xie(2007)SDIRlIs a RING Finger E3Ligase That Positively Regulates Stress-Responsive Abscisic Acid Signaling in Arabidopsis.Plant Cell.19(6): 1912-1929。
[0104] 哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)col-〇:購自 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)。
[01化]實施例l、AtVDAC3基因突變體植株的抗鹽性鑒定
[0106] 取atvdac3基因突變體(ABRC，與clo-0相比，僅atvdac3基因發(fā)生突變，其余基因沒 有變化)株系的種子及哥倫比亞生態(tài)型clo-0擬南芥(WT)植株的種子，分別進(jìn)行如下抗鹽性 鑒定：
[0107] 1、將種子用10%漂白劑進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水洗涂3次。
[0108] 2、分組處理
[0109] 實驗組：將無菌種子懸浮在0.15g/100mL的瓊脂糖水溶液中并鋪板到含lOOmM 化Cl、125mM化Cl和150mM化Cl的1/2MS培養(yǎng)基平板上，將平板在4°C黑暗條件下放置3天， 然后移入24°C的組織培養(yǎng)室(每天16小時光照），培養(yǎng)14天，拍照并觀察植株的生長狀態(tài)。
[0110] 對照組:將無菌種子懸浮在0.15g/100mL的瓊脂糖水溶液中并鋪板到1/2MS培養(yǎng)基 平板上，將平板在4°C黑暗條件下放置3天，然后移入24°C的組織培養(yǎng)室(每天16小時光照）， 培養(yǎng)14天，拍照并觀察植株的生長狀態(tài)。。
[0111] 照片見圖1。在對照組處理中，各個株系的植物的生長狀態(tài)沒有顯著差異。在實驗 組處理中，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（col.WT)的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于突變體株系(atvdac3)植 株。結(jié)果表明，AtVDAC3基因突變能夠明顯降低植物的抗鹽性。
[0112] 實施例2、AtVDAC3基因的功能驗證
[0113] -、過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0114] AtVDAC3基因的核巧酸序列為序列1，開放閱讀框為序列1第1-825位核巧酸，其編 碼的蛋白AtVDAC3的氨基酸序列為序列2。
[0115] 將序列表的序列1自5 '末端第1-822位核巧酸所示的雙鏈DNA分子取代載體pCanG- Myc的ΚρηΙ和BamHI酶切位點之間的小片段，得到重組質(zhì)粒pCanG-Myc-AtVDAC3(即過表達(dá)載 體）。重組質(zhì)粒沁anG-Myc-AtVDAC3的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2，AtVDAC3基因由35S雙啟動子調(diào)控。
[0116] 二、轉(zhuǎn)AtVDAC3擬南芥的獲得
[0117] 1、將上述一制備的過表達(dá)載體pCanG-Myc-AtVDAC3導(dǎo)入根癌±壤桿菌EHA105株 中，得到重組根癌±壤桿菌(提取質(zhì)粒，測序驗證陽性）。
[0118] 2、將步驟1得到的重組根癌±壤桿菌通過植株真空滲入法(Bent AF和Clou曲SJ (1998)Agrobacterium germ-line transformation:transformation of Arabidopsis without tissue culture.In Plant Molecular Biology Manual,2