AtVDAC3蛋白及其編碼基因在培育抗逆性植物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及AtVDAC3蛋白及其編碼基因在培育抗逆性植 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上有至少20%的耕地和超過(guò)50%的灌概±地在不同程度上受 到鹽害的影響。一些干旱或半干旱地區(qū)，由于蒸發(fā)量大、降水量小，致使±壤中的鹽分(主要 是化α和化c〇3)大量積累。一些濱海地帶，地下水位較高或海水倒灌，也會(huì)導(dǎo)致±壤表層積 累較多鹽分(主要是化C1和MgS化）。而不合理的灌概方式W及長(zhǎng)期的淡水洗鹽又造成了大 量農(nóng)田的次生鹽潰化。隨著世界人口的劇增，發(fā)展中國(guó)家城市化進(jìn)程的加劇，W及水資源匿 乏造成的可灌概±地面積的急劇下降，充分開發(fā)和利用鹽堿地已經(jīng)成為關(guān)系人類生存和發(fā) 展的重要課題。
[0003] 鹽脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子之一。根據(jù)植物對(duì)于鹽脅迫的耐受性差 異，可將植物分成鹽生植物和甜±植物兩類。鹽生植物是能在滲透勢(shì)低于-3.31?3的±壤環(huán) 境中生長(zhǎng)并完成生活史的天然植物群體，反之則是甜±植物。
[0004] 大多數(shù)植物尤其是農(nóng)作物屬于甜±植物，對(duì)鹽脅迫敏感。它們?cè)邴}堿地生長(zhǎng)時(shí)，由 于受鹽脅迫作用，生長(zhǎng)緩慢，往往葉片變黃、死亡、脫落，嚴(yán)重影響光合作用，有時(shí)甚至整株 植物枯萎死亡，從而造成農(nóng)作物減產(chǎn)。鹽脅迫已經(jīng)嚴(yán)重的影響了全球的糧食產(chǎn)量，因此，掲 示植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的機(jī)制，并據(jù)此提高植物的抗鹽能力，已經(jīng)成為促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基 礎(chǔ)。
[0005] 鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響主要表現(xiàn)在W下幾個(gè)方面:第一，±壤中鹽分過(guò)高，使± 壤的滲透勢(shì)降低，會(huì)造成植物根系吸水困難，導(dǎo)致植物水分虧缺;第二，鋼離子、氯離子及硫 酸鹽的累積造成的離子毒害，并且導(dǎo)致鐘、巧、憐、氮攝入量不足，從而造成的營(yíng)養(yǎng)脅迫;第 Ξ，當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞中會(huì)大量積累活性氧，而高濃度的活性氧則會(huì)造成膜脂、蛋 白質(zhì)及核酸的破壞。
[0006] 研究植物對(duì)于鹽脅迫的響應(yīng)及耐受的分子機(jī)制，尋找抗鹽相關(guān)基因是近些年來(lái)的 熱點(diǎn)，對(duì)于農(nóng)作物改良和培育耐鹽作物具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如下1)-3)中任一種物質(zhì)的用途。
[000引本發(fā)明提供的如下1)-3)中任一種物質(zhì)在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用：
[0009] 1)蛋白；
[0010] 2)編碼蛋白的DNA分子；
[0011] 3)含有編碼蛋白的DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；
[0012] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[OOU] (1化序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0014] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0015] 為了使（1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0016] 表1標(biāo)簽的序列
[0017]
[0018] ~上述(2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也
可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。' 上述(2)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5/端和/或y端 連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如下1)-3)中任一種物質(zhì)的另一個(gè)用途。
[0020] 本發(fā)明提供的如下1)-3)中任一種物質(zhì)在培育抗逆植物中的應(yīng)用：
[0021] 1)蛋白；
[0022] 2)編碼蛋白的DNA分子；
[0023] 3)含有編碼蛋白的DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；
[0024] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0025] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0026] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0027] 上述應(yīng)用中，所述編碼蛋白的DNA分子是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
[002引 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0029] 2)序列表中序列1第1-822位核巧酸；
[0030] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的 氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0031] 4)與1)或2)所限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至 少具有99%同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0032] 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC、0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、 0.1 % SDS和 1 X SSC、0.1 % SDS各洗膜一次。
[0033] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物抗逆性為提高植物抗逆性。
[0034] 上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗鹽性。
[0035] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;所述雙子葉植物具體為豆科 植物或十字花科植物，具體為擬南芥。
[0036] 本發(fā)明第Ξ個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0037] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基 因植物;所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述目的植物；
[0038] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0039] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0040] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0041] 上述方法中，所述蛋白的編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入目的植物；
[0042] 所述重組載體將編碼所述蛋白的DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)所述蛋白的 載體。具體為將序列表的序列1自5'末端第1-822位核巧酸所示的雙鏈DNA分子取代載體 pCanG-Myc的ΚρηΙ和BamHI酶切位點(diǎn)之間的小片段，得到重組質(zhì)粒pCanG-Myc-AtVDAC3 (即過(guò) 表達(dá)載體）。
[0043] 本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高植物的方法。
[0044] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:將上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物雜 交，獲得抗逆性高于所述出發(fā)植物的雜交后代。
[0045] 上述中，所述抗逆性為抗鹽性。
[0046] 上述中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;所述雙子葉植物具體為豆科植物 或十字花科植物。
[0047] 本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一種重組載體。
[0048] 本發(fā)明提供的重組載體，為將編碼蛋白的DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)蛋白 的重組載體；
[0049] 所述蛋白為如下（1)或(2):
[0050] (1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0051] (2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由（1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0052] 上述重組載體中，所述編碼蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
[0053] 1)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0054] 2)在嚴(yán)格條件下與1)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0化日]3)與1)所限定的DNA分子至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99%同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0056] 所述重組載體具體為將序列表的序列1自5'末端第1-822位核巧酸所示的雙鏈DNA 分子取代載體pCanG-Myc的ΚρηΙ和BamHI酶切位點(diǎn)之間的小片段，得到重組質(zhì)粒pCanG-Myc- AtVDAC3(即過(guò)表達(dá)載體）。
[0057] 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述AtVDAC3基因的重組表達(dá)載體。植物表達(dá) 載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。植物表達(dá)載體還可包含外源基 因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺巧酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片 段。所述聚腺巧酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組植 物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它 們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用;此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載 體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同， W