一種基于微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的建立方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬細(xì)胞生物學(xué)和組織工程的方法，特別涉及一種基于微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的建立方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤腦轉(zhuǎn)移是指原發(fā)于腦外其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移至腦內(nèi)，又叫顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤，其發(fā)病率占腦腫瘤的10% -15%，惡性腫瘤病人的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤可高達(dá)30%。臨床數(shù)據(jù)表明肺癌的腦轉(zhuǎn)移最為多見(jiàn)，其次為乳腺癌、黑色素瘤等，均可發(fā)生不同程度的腫瘤腦轉(zhuǎn)移。雖然在發(fā)病率上，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤不及肝癌和肺癌，但是其臨床表現(xiàn)卻比較嚴(yán)重，多發(fā)生與腫瘤后期或末期，致死率較高。近年來(lái)對(duì)顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的診斷和治療手段逐漸發(fā)展，使得其主語(yǔ)率和換紀(jì)律得到一定程度上的提高，但是由于血腦屏障結(jié)構(gòu)的存在，仍有發(fā)部分藥物無(wú)法應(yīng)用于顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的治療，且顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤多為腦外腫瘤后期甚至末期發(fā)生，可能延誤最佳治療時(shí)機(jī)。因此，體外建立集成血腦屏障結(jié)構(gòu)的高通量顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型，對(duì)于腫瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，以及相應(yīng)藥物的研發(fā)與篩選，都有著至關(guān)重要的意義。
[0003]微流控芯片技術(shù)作為近年來(lái)飛速發(fā)展的一門(mén)新興技術(shù)，依靠其尺度微小、材料和制作工藝多樣、設(shè)計(jì)靈活多變等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等多種臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究的相關(guān)領(lǐng)域。目前，利用微流控芯片建立體內(nèi)功能模塊的模擬和仿生工作逐步產(chǎn)生，但是建立集成血腦屏障結(jié)構(gòu)和腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的方法尚未出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的建立方法及應(yīng)用。本發(fā)明具有通量高、集成度高的特點(diǎn)，同時(shí)具備接近體內(nèi)生理環(huán)境的血腦屏障模型和腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型。
[0005]一種微流控芯片，該芯片包括廢液出口、細(xì)胞入口、和膠原入口、廢液出口通過(guò)二維通道與細(xì)胞入口聯(lián)通，膠原入口與三維通道聯(lián)通；二維通道和三維通道交界處可形成二維與三維微環(huán)境界面。
[0006]每一個(gè)二維通道分別于4個(gè)三維通道聯(lián)通，構(gòu)成一組條件單元，每個(gè)芯片上共有16組條件單元。
[0007]所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層為透明透氣的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，下層材料為高潔凈度的蓋玻片。
[0008]封接之前，上層聚合物經(jīng)過(guò)純乙醇浸泡過(guò)夜烘干處理用于滅菌，然后經(jīng)過(guò)氧氣等離子體處理120秒進(jìn)行不可逆封接。
[0009]所述微流控芯片結(jié)構(gòu)的高度不等，細(xì)胞入口、廢液出口和二維通道的高度比膠原入口、三維通道的高度高150 μ m-250 μ m。
[0010]所述微流控芯片膠原入口和三維通道的高度為80 μ m,細(xì)胞入口、廢液出口和二維通道的高度為300 μ m。
[0011]灌注膠原的終濃度為6mg/mL，形成的單個(gè)二維與三維微環(huán)境界面的面積為ImmX 80 μ m = 0.08mm2。
[0012]一種基于微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的建立方法，采用上述微流控芯片，按照以下步驟進(jìn)行:
[0013]步驟1:建立血腦屏障模型
[0014](I)芯片內(nèi)膠原的灌注
[0015]配制終濃度為6mg/mL的膠原，用灌注泵以連續(xù)灌流的方式將膠原從膠原入口灌入三維通道通道內(nèi)，將固定芯片的培養(yǎng)皿置于37°C培養(yǎng)環(huán)境中孵育凝膠形成三維結(jié)構(gòu)，其中二維通道與三維通道交界的位置即形成二維與三維環(huán)境的交界面；
[0016](2)芯片上的細(xì)胞灌注與培養(yǎng)
[0017]原代提取SD大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(As)，培養(yǎng)至細(xì)胞間產(chǎn)生接觸抑制，分別消化為單細(xì)胞懸液，按照ECs:As = 1:1的比例混合，用灌注泵將混合好的細(xì)胞懸液以連續(xù)灌流的方式從細(xì)胞入口注入二維通道內(nèi)，通道內(nèi)灌滿細(xì)胞懸液后，將芯片整體按照二維通道在上、三維通道在下的方向側(cè)立放置12min-15min，形成致密細(xì)胞層，隨后將芯片平放繼續(xù)培養(yǎng)，形成體外血腦屏障模型；
[0018]步驟2:建立腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型
[0019]從細(xì)胞入口向膠原入口灌注腦外源性腫瘤單細(xì)胞懸液，將整個(gè)芯片以二維通道在上，三維通道在下的方向側(cè)立8min-15min，隨后平放芯片，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，形成腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型。
[0020]基于微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的應(yīng)用，可用于外源性腫瘤細(xì)胞腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的研究，具體為:顯微鏡下觀察貼附于血腦屏障的外源性腫瘤細(xì)胞突破血腦屏障模型以及其轉(zhuǎn)移距離，每24小時(shí)采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)外源性腫瘤細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量和和移動(dòng)距離。
[0021]外源性腫瘤細(xì)胞腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的研究，所研究的腦外源性腫瘤細(xì)胞有A549(肺癌細(xì)胞)、MDA-MB-231 (乳腺癌細(xì)胞)、M624 (黑色素瘤細(xì)胞)。
[0022]外源性腫瘤細(xì)胞腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的研究，既可以向芯片內(nèi)灌注同一種腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，也可以從不同的主通道入口同時(shí)灌入不同的腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，共用同一個(gè)廢液出口，實(shí)現(xiàn)高集成的多細(xì)胞轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的同時(shí)空研究。
[0023]血腦屏障組成成分在腫瘤鬧轉(zhuǎn)換以過(guò)程中的作用研究:分別以?xún)?nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞建立體外血腦屏障模型，考察外源性腫瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，統(tǒng)計(jì)腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞移動(dòng)距離。
[0024]外源性腫瘤細(xì)胞與血腦屏障模型組成成分的識(shí)別作用研究:分別將外源性腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，48小時(shí)后觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及成球情況。
[0025]本發(fā)明應(yīng)用微流控芯片為平臺(tái)，首次體外構(gòu)建了近生理?xiàng)l件的血腦屏障模型，并將此模型應(yīng)用與外源性腫瘤腦轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象和機(jī)制研究，為腦瘤疾病新藥的開(kāi)發(fā)與篩選提供了重要平臺(tái)。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1本發(fā)明所述微流控芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖2本發(fā)明所述微流控芯片血腦屏障結(jié)構(gòu)的示意圖；
[0028]圖3本發(fā)明所述微流控芯片外源性腫瘤腦內(nèi)轉(zhuǎn)移的結(jié)果圖；
[0029]圖4本發(fā)明所述微流控芯片外源性腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用；
[0030]圖5本發(fā)明所述微流控芯片外源性腫瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互在作用；
[0031]圖6外源性腫瘤細(xì)胞分別于內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的識(shí)別作用，其中a)為腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的識(shí)別作用山)為腫瘤細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的識(shí)別作用；
[0032]其中:I廢液出口，2細(xì)胞入口，3膠原入口，4三維通道，5 二維通道，6 二維與三維微環(huán)境界面。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0034]一種微流控芯片，該芯片包括廢液出口 1、細(xì)胞入口 2、和膠原入口 3、廢液出口 I通過(guò)二維通道5與細(xì)胞入口 2聯(lián)通，膠原入口 3與三維通道3聯(lián)通；二維通道5和三維通道4交界處可形成二維與三維微環(huán)境界面6。
[0035]每一個(gè)二維通道5分別于4個(gè)三維通道4聯(lián)通，構(gòu)成一組條件單元，每個(gè)芯片上共有16組條件單元。
[0036]所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層為透明透氣的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，下層材料為高潔凈度的蓋玻片。
[0037]封接之前，上層聚合物經(jīng)過(guò)純乙醇浸泡過(guò)夜烘干處理用于滅菌，然后經(jīng)過(guò)氧氣等離子體處理120秒進(jìn)行不可逆封接。
[0038]所述微流控芯片結(jié)構(gòu)的高度不等，細(xì)胞入口 2、廢液出口 I和二維通道5的高度比膠原入口 3、三維通道4的高度高150 μ m-250 μ m。
[0039]所述微流控芯片膠原入口 3和三維通道4的高度為80 μ m,細(xì)胞入口 2、廢液出口I和二維通道5的高度為300 μ m。
[0040]灌注膠原的終濃度為6mg/mL，形成的單個(gè)二維與三維微環(huán)境界面的面積為ImmX 80 μ m = 0.08mm2。
[0041]一種基于權(quán)利要求1所述微流控芯片的腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型的建立方法，采用上述微流控芯片，按照以下步驟進(jìn)行:
[0042]步驟1:建立血腦屏障模型
[0043](2)芯片內(nèi)膠原的灌注
[0044]配制終濃度為6mg/mL的膠原，用灌注泵以連續(xù)灌流的方式將膠原從膠原入口 3灌入三維通道4通道內(nèi)，將固定芯片的培養(yǎng)皿置于37°C培養(yǎng)環(huán)境中孵育凝膠形成三維結(jié)構(gòu)，其中二維通道5與三維通道4交界的位置即形成二維與三維環(huán)境的交界