一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于哈維弧菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重要貝類(lèi)一一鮑的病原哈維弧 菌的選擇性顯色培養(yǎng)基及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膿皰癥是威脅重要貝類(lèi)品種一一鮑的重要疾病之一，早期已見(jiàn)報(bào)道，且已被列入 中國(guó)水生動(dòng)物三類(lèi)疫病名錄中。該病由弧菌病原引起，通過(guò)血淋巴進(jìn)入鮑的全身組織，以感 染稚鮑為主，夏季易發(fā)病，特別是連續(xù)高溫時(shí)，發(fā)病頻繁且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，常導(dǎo)致皺紋盤(pán)鮑和 雜色鮑死亡，死亡率可高達(dá)50%~60%，因而給鮑養(yǎng)殖業(yè)造成極為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我們前 期的研究結(jié)果確診了膿皰病的病原是哈維弧菌Vibrio harveyi。哈維弧菌也是近年來(lái)在海 水貝類(lèi)養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)頻率最高的病原之一。
[0003] 目前，在病原菌的鑒定方面主要有傳統(tǒng)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方 法等，而這些方法多數(shù)難以進(jìn)行快速估算病原菌的數(shù)量，且難以在短時(shí)間內(nèi)獲得病原菌種 資源并與其它弧菌迅速區(qū)分，非常不利于及時(shí)地對(duì)癥治療。此外，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中通過(guò) 顯色方法直接診斷海水貝類(lèi)主要病原菌并快速評(píng)估病原菌數(shù)量方面，屬空白領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基，該顯色培養(yǎng)基 能對(duì)鮑的膿皰癥病原哈維弧菌進(jìn)行快速區(qū)分和鑒定。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供利用上述鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基進(jìn)行檢 測(cè)和估數(shù)的方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短、成本低。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種鮑病原哈維弧菌的選擇 性顯色培養(yǎng)基，每1000mL培養(yǎng)基中含有蛋白胨5~15g、牛肉膏3~5g、蔗糖10~15g、氯化鈉 15~258、卡那霉素0.3~0.58、苯酚紅0.02~0.038，蒸餾水100011^定容，最終?!1為7.8~ 8.2〇
[0007] 優(yōu)選的，本發(fā)明提供的一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基，每1000mL培養(yǎng) 基中含有蛋白胨8~12g、牛肉膏3~4g、蔗糖10~12g、氯化鈉18~22g、卡那霉素0.3~0.4g、 苯酚紅0.022~0.028g，蒸餾水1000mL定容，最終pH為8.0~8.2。
[0008] 最佳的，本發(fā)明提供的一種鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基，每1000mL培養(yǎng) 基中含有蛋白胨l〇.〇g、牛肉膏3.0g、蔗糖10.0g、氯化鈉20.0g、卡那霉素0.4g、苯酚紅 0 · 025g，蒸餾水1000mL定容，最終pH為8 · 2。
[0009] 本發(fā)明中的選擇性顯色培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成比例和鹽度、pH值等均非常利于鮑病原 哈維弧菌的快速生長(zhǎng)，同時(shí)利用該病原類(lèi)群對(duì)高濃度卡那霉素的抗性，可完全抑制其它弧 菌種類(lèi)的生長(zhǎng)，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌等中區(qū)分出來(lái)， 并可通過(guò)顯色時(shí)間初步評(píng)估哈維弧菌數(shù)量級(jí)。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:采用上述鮑病原哈維弧菌的 選擇性顯色培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)和估數(shù)的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)制備鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基:按用量關(guān)系，取各原料蛋白胨、牛 肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅，溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值后，高壓滅菌并冷卻，根據(jù)用量關(guān)系 加入卡那霉素，定谷后低溫保存待用；
[0012] (2)建立鮑病原哈維弧菌顯色時(shí)間表:取上述選擇性顯色培養(yǎng)基，加入鮑病原哈維 弧菌，配制成鮑病原哈維弧菌濃度梯度范圍為1〇 3~1〇8的顯色反應(yīng)液，封口后搖床培養(yǎng)箱培 養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)，鮑病原哈維弧菌置于上述選擇性顯色培養(yǎng)基中顯示黃色，根據(jù)不同濃度 的鮑病原哈維弧菌顯色反應(yīng)液完全顯色為黃色的顯示時(shí)間，建立顯色時(shí)間表如下：
[0013]
[0014] (3)鮑病原哈維弧菌的檢測(cè)：取鮑組織樣品，置于上述選擇性顯色培養(yǎng)基中，封口 后搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的 是陽(yáng)性樣品，樣品顏色顯示為淡紅色的是陰性樣品，記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根 據(jù)顯示時(shí)間表，確定鮑病原哈維弧菌的數(shù)量級(jí)。
[0015] 本發(fā)明的原理是:鮑病原哈維弧菌在選擇性顯色培養(yǎng)基快速增殖后，代謝產(chǎn)物形 成的酸性環(huán)境可使指示劑苯酚紅立即反應(yīng)從而顯示不同顏色，通過(guò)比對(duì)顯色時(shí)間表，可評(píng) 估其中的病原菌數(shù)量級(jí)，簡(jiǎn)易快捷。
[0016] 同時(shí)利用哈維弧菌對(duì)卡那霉素的抗性，以及細(xì)菌對(duì)碳源利用能力的不同，利用苯 酚紅的顏色指示變化，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌中區(qū)分出 來(lái)，并可通過(guò)顯色時(shí)間初步評(píng)估哈維弧菌數(shù)量級(jí)。
[0017] 在上述鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)和估數(shù)的方法中：
[0018] 步驟（1)中高壓滅菌時(shí)溫度優(yōu)選為115~121°C，時(shí)間優(yōu)選為15~20分鐘。最佳為在 121 °C尚壓滅菌15分鐘。
[0019] 步驟(1)中冷卻優(yōu)選至15~20°C。
[0020] 步驟(2)~(3)中搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)溫度優(yōu)選為30~35 °C恒溫培養(yǎng)，最佳為30 °C。 [0021] 步驟(2)~(3)中顯色反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5~16小時(shí)。
[0022]步驟(3)中所述的鮑組織樣品優(yōu)選為鮑的內(nèi)臟或足部肌肉組織。
[0023]步驟(3)中所述鮑組織樣品與選擇性顯色培養(yǎng)基的用量關(guān)系優(yōu)選為0.3~0.5g:7 ~8mL〇
[0024]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] (1)本發(fā)明的鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基以苯酚紅作為顯色劑，同時(shí)添 加了定量的卡那霉素，大大提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性，陽(yáng)性結(jié)果顯色明顯，觀察方便，且可通過(guò)顯 色時(shí)間長(zhǎng)短可對(duì)病原哈維弧菌數(shù)量進(jìn)行評(píng)估預(yù)測(cè)；
[0026] (2)本發(fā)明利用哈維弧菌對(duì)卡那霉素的抗性，以及細(xì)菌對(duì)碳源利用能力的不同，利 用苯酚紅的顏色指示變化，可有效將病原哈維弧菌從副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌中區(qū) 分出來(lái)，并可通過(guò)顯色時(shí)間初步評(píng)估哈維弧菌數(shù)量級(jí)；
[0027] (3)本發(fā)明以選擇性顯色培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)繁瑣的分離鑒定方法，通過(guò)顯色反應(yīng)可 以直接對(duì)重要貝類(lèi)品種一一鮑的膿皰癥病原哈維弧菌進(jìn)行鑒定，方便快捷；
[0028] (4)本發(fā)明液體顯色培養(yǎng)基制作工藝簡(jiǎn)單，能有效的檢測(cè)培養(yǎng)貝類(lèi)病原哈維弧菌， 特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，成本低，可用于鮑等重要貝類(lèi)常見(jiàn)病原哈維弧菌的快速檢測(cè) 和數(shù)量預(yù)測(cè)，減少疾病造成的經(jīng)濟(jì)損失；
[0029] (5)本發(fā)明鑒定和評(píng)估數(shù)量的步驟簡(jiǎn)單，從取樣到獲得結(jié)果只需數(shù)小時(shí)即可完成， 大大簡(jiǎn)化了操作步驟，也不需要使用復(fù)雜的檢測(cè)儀器，從而節(jié)省了時(shí)間，鑒定和定量的成本 低，有利于在基層檢測(cè)部門(mén)推廣應(yīng)用，很大程度提高了工作效率。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例6中創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維弧菌的顯色結(jié)果， 其中1是創(chuàng)傷弧菌，2是副溶血弧菌，3是溶藻弧菌，4是哈維弧菌，其中1~3顯示結(jié)果為淡紅 色，為陰性，4哈維弧菌顯示為黃色，為陽(yáng)性，淡紅色為陰性反應(yīng)，黃色為陽(yáng)性反應(yīng)；
[0031] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例7中患病個(gè)體內(nèi)臟組織樣品和健康個(gè)體的內(nèi)臟樣品顯色結(jié)果， 其中1是空白對(duì)照（陰性，淡紅色），2是健康個(gè)體內(nèi)臟組織樣品（陰性，淡紅色），3是患病個(gè)體 的內(nèi)臟組織樣品（陽(yáng)性，黃色）；
[0032]圖3是本發(fā)明實(shí)施例8中患病個(gè)體足部組織樣品和健康個(gè)體的組織樣品顯色結(jié)果， 其中1是空白對(duì)照（陰性，淡紅色）；2是健康個(gè)體的足部肌肉組織（陰性，淡紅色）；3是患病個(gè) 體的足部肌肉組織樣品（陽(yáng)性，黃色）。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1
[0034]鮑病原哈維弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為:每1000mL培養(yǎng)基中含有蛋白胨10g、 牛肉膏3g、鹿糖10g、氯化鈉20g、卡那霉素0.4g、苯酸紅0.025g，蒸餾水1000mL定容，最終pH 為 8·2〇
[0035] 其制備方法為：按用量關(guān)系，取各原料蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅，溶 于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為8.2后，高壓滅菌并冷卻，根據(jù)用量關(guān)系加入卡那霉素，定容至 1000mL，低溫保存待用。
[0036] 高壓滅菌時(shí)溫度為115~121°C，時(shí)間為15~20分鐘;冷卻至15~20°C。
[0037] 建立鮑病原哈維弧菌顯色時(shí)間表:取上述選擇性顯色培養(yǎng)基，加入鮑病原哈維弧 菌，配制成鮑病原哈維弧菌濃度梯度范圍為10 3、104、105、106、107和10 8的顯色反應(yīng)液，封口 后搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)，鮑病原哈維弧菌置于上述選擇性顯色培養(yǎng)基中顯示黃 色，根據(jù)不同濃度的鮑病原哈維弧菌顯色反應(yīng)液完全顯色為黃色的顯示時(shí)間，建立顯色時(shí) 間表如下：
[0038]
[0039] 鮑病原哈維弧菌的檢測(cè)：取鮑樣品組織，置于上