一種單組份tmb顯色液的終止液及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物體外診斷試劑，特別是涉及一種單組份TMB顯色液的終止液及其 制備方法。
【背景技術】
[0002] 體外診斷試劑領域的酶聯(lián)免疫法（ELISA)檢測技術中，常使用TMB(3, 3'，5, 5'-四 甲基聯(lián)苯胺）作為HRP (辣根過氧化物酶）顯色底物。相對其它顯色底物而言，TMB以顯色 高效、無毒、不致癌、穩(wěn)定性好等特點成為ELISA檢測的主流顯色劑。在ELISA檢測時，HRP 酶催化過氧化物釋放出氧使TMB被氧化成藍色的產物，加入酸性的終止液終止反應后，藍 色溶液變成橙黃色，在450nm波長有最大吸收峰。終止的原理：以硫酸為主要成分的終止液 為例，加入終止液后，一方面，硫酸破壞了 HRP酶的活性，使酶的催化功能喪失；另一方面， 由于pH降低，可使藍色的陽離子根轉變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消 光系數(shù)。如不及時終止反應，本底會同時加深，進而影響結果的正確判斷，故終止對ELISA 具有重要意義。
[0003] 目前ELISA試劑盒中，TMB的終止液主要有酸和堿兩類：酸類主要為鹽酸及硫酸， 而堿類則為NaOH及SDS (十二烷基硫酸鈉）。NaOH由于易與空氣中的二氧化碳反應產生 變質，而較少應用；至于1% SDS (十二烷基硫酸鈉）雖有論文進行過研究，但由于其終止后 有較強的褪色作用，結果不穩(wěn)定，基本僅停留于實驗室使用。對于酸類中的鹽酸，濃度多為 1%或2M(即mol/1，下同），終止效果尚可，但由于鹽酸易揮發(fā)，多次開蓋會使溶質減少，進 而影響終止液的終止效果及檢測精密度，故商品化應用不多。
[0004] 硫酸作為終止液的主要成分，由于穩(wěn)定、易獲取、廉價等優(yōu)點逐漸成為主流。其所 配制的硫酸濃度各異，包括最高達2M，最低為0. 2M。而終止液的具體加量：一般雙組份TMB 底物液各加 A與B液50 μ 1后，再加2M的終止液50 μ 1 ;而對于單組份TMB底物液，則多采 用0. 2-0. 8Μ的更低濃度硫酸作為終止液，而與TMB加量相同，例如100 μ 1的TMB底物液， 加入100 μ 1的終止液。
[0005] 對于傳統(tǒng)的2mol/l的硫酸終止液，多用于雙組份ΤΜΒ，較少應用于單組份TMB中。 原因有：（1)單組份TMB中的TMB含量較雙組份中的低，故不需高達2M的硫酸來終止，過量 的硫酸反而會使本底加深，導致陰陽性對比度較差，最終讀數(shù)不穩(wěn)定。（2)2M的硫酸有較強 的腐蝕性，對操作者易造成傷害。（3)使用剩余的終止液對環(huán)境產生了危害。故現(xiàn)在更多是 使用低濃度的硫酸作為終止液，如〇. 2-0. 8M。
[0006] 基于低濃度的硫酸即稀硫酸在常溫條件下可穩(wěn)定保存，故其可直接保存于常溫， 在冬季時，特別是廣東、海南及臺灣省以外的省份，冬季實驗室保存或運輸時多在〇°C以下， 易使室溫保存的終止液產生凍結；此外，在控溫不穩(wěn)的冰箱冷藏層，終止液也可能出現(xiàn)凍 結。凍結的終止液有以下缺點：解凍需要耗費時間；如未完全融化、不均勻會導致硫酸的 濃度產生變化，影響實驗精密度。
[0007] 單組份TMB顯色液日趨成為商品化ELISA試劑盒主流，目前很少有專門針對單組 份TMB顯色液的終止液。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種專門針對單組份TMB顯色液的終止液，其作 用高效且可穩(wěn)定的保存于四季室溫。
[0009] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括硫酸和二乙二醇。
[0010] 所述硫酸的濃度為〇· 3-0. 5mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3-5%。
[0011] 所述硫酸的濃度為〇. 4mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3%。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有硫酸和二乙二醇的組合物的用途，用于單組份TMB顯色 液的終止液的制備。
[0013] 組合物中所述硫酸的濃度為0. 3-0. 5mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為 3-5 % 〇
[0014] 組合物中所述硫酸的濃度為0. 4mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3%。
[0015] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)勢：
[0016] (1)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液是專門針對單組份TMB底物液設計的，終止 后不產生沉淀，1小時內讀數(shù)仍穩(wěn)定。
[0017] (2)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液采用的是低濃度的硫酸，可以減少對操作 者的傷害，并且可以降低對環(huán)境的危害。
[0018] (3)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液具有防凍設計，通過其含有的特有防凍成 分與低濃度的硫酸以一定比例組合使用，作用高效，且在冬季低溫環(huán)境使用而不凍結，更加 穩(wěn)定和可靠。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括如下濃度的各組分：
[0020] 硫酸 0· 3-0. 5mol/L
[0021] 二乙二醇 3-5% (w/v)
[0022] 所述硫酸的濃度為0. 3M及以上，可確保足量的硫酸用于終止，同時也維持一個較 強的酸性環(huán)境，抑制微生物的生長。而硫酸的濃度為0. 5M以上時，終止后的穩(wěn)定性不夠，易 引起讀數(shù)的變化。如高值樣本時，可能帶來部分沉淀，故選擇〇. 3-0. 5M。
[0023] 所述二乙二醇，也稱一縮二乙二醇、二乙二醇醚或二甘醇。能與乙醇、乙醚、丙酮和 乙二醇混溶，不溶于苯和四氯化碳，溶于水。味辛辣并微甜，有吸濕性。由于部分抗凍成分易 造成終止反應的干擾。故在抗凍劑的類型及其濃度上的選擇上需要特別慎重，如甘油等物 質量大時粘度增大，不利于終止反應的高效進行。而二乙二醇則不會對ELISA的終止造成 干擾，有與甘油相當?shù)目箖鲂Ч蓾M足常見的近零攝氏度的抗凍的情況，如_5°C至0°C ; 同時其安全性較好；其濃度選擇為3-5% (w/v)時更有利于終止反應的高效進行。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述單組份TMB顯色液的終止液的制備方法，包括如下步驟：
[0025] 取16. 0-26. 8ml (即0· 3-0. 5mol)的硫酸，加入800ml的去離子水，再在其中加入 26. 9-44. 8ml (即30-50g)的二乙二醇，用去離子水定容至1L，混合均勾，盛放于塑料試劑瓶 中密封存于室溫，即為單組份TMB顯色液的終止液。
[0026] 實施例1
[0027] 本實施例提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括如下濃度的各組分：
[0028] 硫酸 0· 4mol/L
[0029] 二乙二醇 3%(w/v)
[0030] 本實施例還提供了上述單組份TMB顯色液的終止液的制備方法，包括如下步驟：
[0031] 取21. 4ml (即0. 4mol)的硫酸，加入800ml的去離子水，再在其中加入26. 9ml (即 30g)的二乙二醇，用去離子水定容至1L，混合均勻，盛放于塑料試劑瓶中密封存于室溫，即 為單組份TMB顯色液的終止液。
[0032] 其中濃酸和二乙二醇均為國產分析純試劑，成本較低。
[0033] 本實施例單組份TMB顯色液的終止