一種鹿角靈芝菌液發(fā)酵培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種鹿角靈芝菌液發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]靈芝別名萬年蕈或靈芝草，屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，靈芝菌屬，其中的鹿角靈芝(Ganoderma amboinense)生長中會形成類似鹿角的形態(tài)，屬于靈芝中的名貴品種。近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鹿角靈芝有增強(qiáng)免疫，促進(jìn)新陳代謝，抗腫瘤，延緩衰老等作用，其關(guān)鍵活性成分是靈芝多糖和靈芝三萜。
[0003]傳統(tǒng)人工栽培靈芝，周期長，生產(chǎn)效率低，受環(huán)境影響大。而通過靈芝液體發(fā)酵技術(shù)，不但能短時間內(nèi)培養(yǎng)出大量菌絲體，縮短生產(chǎn)時間，而且能獲得質(zhì)量好且穩(wěn)定的目標(biāo)活性產(chǎn)物，營養(yǎng)和藥用價值都不低于子實體，正逐步應(yīng)用于藥物，食品，美容化妝品等領(lǐng)域。靈芝液體發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵在于尋找適合的菌株，一方面要有較高的靈芝多糖和靈芝三萜類化合物產(chǎn)量，一方面要能適應(yīng)簡單的培養(yǎng)方法和廉價的培養(yǎng)基成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種鹿角靈芝菌液發(fā)酵培養(yǎng)方法，通過本發(fā)明發(fā)酵后，鹿角靈芝發(fā)酵液中含有較高含量的靈芝多糖和靈芝三萜類化合物。
[0005]靈芝多糖具有廣泛的藥理活性，能提尚機(jī)體免疫力，提尚機(jī)體耐缺氧能力，消除自由基，抑制腫瘤、抗輻射，提高肝臟、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白質(zhì)能力，延長壽命，靈芝多糖還具有刺激宿主非特異性抗性、免疫特異反應(yīng)以及抑制移植腫瘤生理活性的特性。對心血管疾病、氣喘、過敏、神經(jīng)衰弱、胃熱等有顯著效果。還具有降血壓、降血脂、降血瘀、改善血液循環(huán)、皮膚美容等作用。
[0006]靈芝三萜類化合物的藥理作用為:保肝作用；抗腫瘤作用；抗HIV-1'及HIV-1蛋白酶活性;抑制組胺釋放;抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE);抑制膽固醇合成;鎮(zhèn)痛作用;對血小板聚氯的影響;對蛋白金合歡酯轉(zhuǎn)移酶的抑制作用;抗氧化作用;抑制真核細(xì)胞DNA多聚酶活性。
[0007]—種鹿角靈芝菌液發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體步驟如下:
[0008](I)母種擴(kuò)增
[0009]無菌條件下剖取小塊鹿角靈芝菌的母鐘，移接到斜面培養(yǎng)基上，加塞，至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25-29 °C中培養(yǎng)7天;優(yōu)選的，菌株NCPSLZ1移接到斜面培養(yǎng)基上，27 °C中培養(yǎng)7天；
[0010]斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯洗凈，去皮，稱取200g，切成小塊，與30g麥麩，加水100mL煮沸，保持30min，過濾，濾液中加入瓊脂20g，加熱使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂Ig，pH為7.0，分裝入試管，放入高壓滅菌鍋滅菌，溫度為121°C，時間為30min，制成試管斜面(18_X 180mm)備用；
[ΟΟ??] (2)種子液制備
[0012]在斜面培養(yǎng)基上取I cm2的菌絲體，接種于種子液培養(yǎng)基中，置于搖床中25-29 V、140-160r/min培養(yǎng)7天;優(yōu)選為，菌絲體接種于種子液培養(yǎng)基中，置于搖床中27°C、150r/min培養(yǎng)7天
[0013]種子液培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計:15% 土豆汁，3 %麥麩，3 %葡萄糖，0.2 %磷酸二氫鉀，0.1 %硫酸鎂，pH為7.0，培養(yǎng)液分裝于500mL三角瓶中，每瓶裝250mL，121°C滅菌30min，冷卻后取出備用。
[0014](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0015]將種子液按10%(v/v)接種量接種到發(fā)酵罐中，25-29°C恒溫培養(yǎng)80h，其中0-36小時菌絲體遲緩期內(nèi)攪拌速度90-110r/min，36-70小時菌絲體對數(shù)生長期內(nèi)攪拌速度110-130r/min，70-80小時菌絲體生長穩(wěn)定期內(nèi)攪拌速度90_110r/min ；優(yōu)選的，0_36小時菌絲體遲緩期內(nèi)攪拌速度100r/min ； 36-70小時菌絲體對數(shù)生長期內(nèi)攪拌速度120r/min，70-80小時菌絲體生長穩(wěn)定期內(nèi)攪拌速度100r/min。
[0016]發(fā)酵罐培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):20% 土豆汁，3 %的麥麩，3 %葡萄糖，0.2 %磷酸二氫鉀，0.1%硫酸鎂，pH為7.0。
[0017]利用上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)鹿角靈芝菌株NCPSLZ1，菌株NCPSLZ1的保藏編號為CCTCCN0.M2015796;保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏日期為2015年12月29日；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，該鹿角靈芝菌株NCPSLZ1為Ganoderma amboinense NCPSLZ1。
[0018]菌株NCPSLZ1由金唯智生物科技(北京)有限公司進(jìn)行18sDNA菌種鑒定，結(jié)果表明該菌株屬于鹿角靈芝(Ganoderma amboinense NCPSLZ1)，并與已公開的鹿角靈芝菌株18sDNA序列有區(qū)別，同源性低于100%。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:
[0020]通過本發(fā)明培養(yǎng)方法，鹿角靈芝菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中含有較高含量的靈芝多糖和靈芝三萜類化合物。通過鹿角靈芝菌株NCPSLZ1的檢測試驗，利用本發(fā)明培養(yǎng)方法發(fā)酵，生物量為12.5g/L，胞內(nèi)多糖為137mg/L，三萜類化合物為55mg/L，產(chǎn)量較未優(yōu)化前的搖瓶發(fā)酵又有了很大的提高。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為不同碳源對本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生物量的影響；
[0022]圖2為不同氮源對本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生物量的影響；
[0023]圖3為本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生長曲線圖；
[0024]圖4為初始pH對本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生物量的影響；
[0025]圖5為土豆汁濃度對本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生物量的影響；
[0026]圖6為接種量對本發(fā)明鹿角靈芝菌絲體生物量的影響；
[0027]圖7為本發(fā)明鹿角靈芝菌絲球形態(tài)圖；
[0028]圖8為本發(fā)明鹿角靈芝在奧林巴斯光電顯微鏡AH-2油鏡下的菌絲形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0030]實施例1一種鹿角靈芝菌液體培養(yǎng)的方法，具體步驟如下:
[0031](I)母種擴(kuò)增
[0032]無菌條件下剖取小塊鹿角靈芝菌的母鐘，移接到斜面培養(yǎng)基上，加塞，至恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，27 °C中培養(yǎng)7天；
[0033]斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯洗凈，去皮，稱取200g，切成小塊，與30g麥麩，加水100mL煮沸，保持30min，過濾，濾液中加入瓊脂20g，加熱使其全部融化后，加入葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂Ig，pH為7.0，分裝入試管，放入高壓滅菌鍋滅菌，溫度為121°C，時間為30min，制成試管斜面(18_X 180mm)備用；
[0034](2)種子液制備
[0035]在斜面培養(yǎng)基上取Icm2的菌絲體，接種于種子液培養(yǎng)基中，置于搖床中27°C、150r/min 培養(yǎng)7天。
[0036]種子液培養(yǎng)基，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計:15% 土豆汁，3 %麥麩，3 %葡萄糖，0.2 %磷酸二氫鉀，0.1 %硫酸鎂，pH為7.0，培養(yǎng)液分裝于500mL三角瓶中，每瓶裝250mL，121°C滅菌30min，冷卻后取出備用。
[0037](3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0038]將種子液按10% (v/v)接種量接種到發(fā)酵罐中，25_29°C恒溫培養(yǎng)80h，其中0-36小時菌絲體遲緩期內(nèi)攪拌速度100r/min，36-70小時菌絲體對數(shù)生長期內(nèi)攪拌速度120r/min，70-80小時菌絲體生長穩(wěn)定期內(nèi)攪拌速度100r/min。
[0039]發(fā)酵罐培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):20% 土豆汁，3 %的麥麩，3 %葡萄糖，0.2 %磷酸二氫鉀，0.1%硫酸鎂，pH為7.0。
[0040]實施例2鹿角靈芝菌產(chǎn)靈芝多糖和三萜類化合物能力評估
[0041 ] 鹿角靈芝菌選用鹿角靈芝菌株NCPSLZ1，菌株NCPSLZ1的保藏編號為CCTCCN0.M2015796;保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏日期為2015年12月29日；保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0042]評估時使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配方(按質(zhì)量百分比計)為15%土豆汁，3 %的麥麩，3 %葡萄糖，0.2 %磷酸二氫鉀，0.1 %硫酸鎂，pH為7.0。接種量為5 %(V/V),500mL搖瓶(裝液2501^)，15(^/11^11，27±2°(:恒溫培養(yǎng)7011得評估用發(fā)酵液，進(jìn)一步得凍干菌絲粉。
[0043]菌株NCPSLZ1菌絲體生物量的測定采用干重法:將發(fā)酵液在4°C，8000r/min條件下高速離心1min;將沉淀用蒸餾水多次洗滌，凍干，計算靈芝菌絲體的生物量(菌絲體干重g/L發(fā)酵液或菌絲體干重/g)，各指標(biāo)測定兩次，取平均值。
[0044]本發(fā)明中靈芝多糖定量檢測采用苯酚-硫酸法:以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;將菌株發(fā)酵液減壓濃縮至原體積的五分之一，用4倍體積的無水乙醇沉淀，于4°C冰箱中靜置12h，離心，沉淀加蒸餾水溶解，高速離心，上清液凍干后為靈芝胞外多糖粉;將Ig靈芝凍干菌絲粉與50mL蒸饋水，沸水浴Ih，過濾，沉淀再與50mL蒸饋水沸水浴Ih，合并兩次濾液，與4倍體積的無水乙醇混合，于4°C冰箱中靜置12h，離心，沉淀加蒸餾水溶解，高速離心，上清液凍干得靈芝胞內(nèi)多糖粉;使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線和多糖粉測定靈芝多糖含量。
[0045]三萜類化合物檢測采用香草酸一冰醋酸法:使用齊墩果酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取Ig菌絲粉與25mL無水乙醇混合，超聲1.5h后，過濾，收集濾液。78 °C水浴濃縮，定容至1mL ；使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線和所定容的溶液測定三萜類化合物含量。
[0046]結(jié)果: