一種治療腎癌的倍半萜化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的獨(dú)活中分離得到的一種新的倍半萜 類(lèi)化合物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angel ica pubescens Maxim, f.biserrata Shan et Yuan的干燥根。春初苗剛發(fā)芽或秋末莖葉枯萎時(shí)采挖，除去須根及泥沙，烘至半干，堆置 2~3天，發(fā)軟后再烘至全干。性微溫，味辛、苦，歸腎、膀胱經(jīng)。有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、解表之 功效，臨床上主要用于治療風(fēng)寒濕痹、腰膝疼痛、風(fēng)寒挾濕表證、少陰伏風(fēng)頭痛等證。始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，言其"味苦，平。主風(fēng)寒所擊，金瘡止痛，奔豚，癇痙，女子疝瘕。月艮 輕身耐老"。主產(chǎn)于湖北、四川、陜西、浙江等地，又稱川獨(dú)活、資丘獨(dú)活、巴東獨(dú)活、恩施獨(dú) 活、肉獨(dú)活、浙獨(dú)活、績(jī)獨(dú)活、香獨(dú)活等，以根條粗壯，油潤(rùn)，質(zhì)軟，香氣濃者為佳。
[0003] 目前從各種不同品種獨(dú)活中已分離出香豆素、萜類(lèi)、揮發(fā)油、有機(jī)酸和糖類(lèi)等多種 化學(xué)成分。香豆素是獨(dú)活重要的活性成分。香豆素(Coumarin)是具有苯駢α-吡喃酮結(jié)構(gòu)的 一類(lèi)化合物?？煽醋魇琼樖洁徚u基桂皮酸脫水而形成的內(nèi)酷，絕大多數(shù)在C 7位有羥基或烴 基，具有芳香氣味。
[0004] 現(xiàn)代研究證實(shí)，獨(dú)活具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、抗氧化、抗衰老、抗腫 瘤、抗血管生成等藥理作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的獨(dú)活中分離得到的一種新的倍半萜類(lèi)化合物， 含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I):
[0008]
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將干燥的獨(dú)活粉碎，用80~ 90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇 取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用75%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集 75%洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫濃縮物用正相 硅膠分離，依次用體積比為65:1、30:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分； (d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、8:1和5:1的二氯甲烷_(kāi) 甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用 體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到純的化合物(I)。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用85%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
[0012] 藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物(I)在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療腎癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)計(jì)算E⑶和實(shí)驗(yàn)E⑶圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0021 ] 主要材料、試劑來(lái)源及儀器類(lèi)型：
[0022]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0023]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0024] (a)將干燥的獨(dú)活(8kg)粉碎，用85 %乙醇熱回流提取(30L X 3次），合并提取液，濃 縮至無(wú)醇味(6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次)和水飽和的正丁醇(6L X 3 次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（375g)和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔樹(shù)脂除雜，先用5%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用75%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，收集75 %洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫濃縮物（129g);(c)步驟(b)中75 %乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8 個(gè)柱體積)和8:1(10個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至Ij4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分 4(27g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為12:1 (8個(gè)柱體積）、8:1 (10個(gè)柱體積)和5:1 (8個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(15g)用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè) 柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I) (40mg)。
[0025] 結(jié)構(gòu)確證:無(wú)色油狀物;冊(cè)43頂3顯示[1+似]+為111/2 259.1720，結(jié)合核磁特征可 得分子式為C15H24〇2，不飽和度為4。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，400MHz):H-1 (2 · 19， m)，H-2(1.93，m)，H-2(2.01，m)，H-3(1.38，m)，H-3(1.56，m)，H-5(3.18，m)，H-6(1.54，m)，H-6(1.67，ddd，J=12.7，11.0,2.4)，H-8(1.93，m)，H-8(2.02，m)，H-9(1.49，m)，H-9(1.55，m)， H-10(5.02，t，J=6.5)，H-12(1.54，s)，H-13(1.56，s)，H-14(4.60，s)，H-14(4.69，s)，H-15 (3.24，(1，了=11.1)，!1-15(3.47，111) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。(卯111，0130-(16，1001抱）：37.4(〇1， 1-C)，27.6(CH2,2-C)，29.3(CH2,3-C)，68.2(C，4-C)，58.7(CH，5-C)，35.1(CH2,6-C)，155.2 (C，7-C)，35.6(CH2,8-C)，27.0(CH2,9-C)，125.1(CH，10-C)，131.8(C，n-C)，17.6(CH 3，12-C)，25 · 4(CH3，13-C)，107 · 5(CH2，14-C)，68 · 9(CH2，15-C);碳原子標(biāo)記參見(jiàn)圖 1 ,Η-NMR譜顯 示了兩個(gè)甲基信號(hào)[SH1.54(3H，s，H-12)和1.56(3!1，8，!1-13)]，一個(gè)烯屬亞甲基[6!14.60(8， H-14)和4.69(8，!1-14)]，一個(gè)含氧亞甲基[5!13.24((1，了=11.1!^，!1-15)和3.47(111，!1-15)]， 一個(gè)烯屬次甲基質(zhì)子信號(hào)[陽(yáng)5.02(^ = 6.5抱，!1-10)]，一個(gè)含氧次甲基信號(hào)[6!13.18(111， H-5)L13C-NMR譜顯示了 15個(gè)共振碳信號(hào)，包括兩個(gè)甲基，七個(gè)亞甲基(一個(gè)烯屬亞甲基，一 個(gè)含氧亞甲基），三個(gè)次甲基(一個(gè)烯屬次甲基，一個(gè)含氧次甲基），以及三個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴 季碳，一個(gè)含氧季碳）。HMBC譜中，H2-15 (δΗ3 · 24，3 · 47)，與C-3 (SC29 · 3)，C-4 (SC68 · 2)和C-5 0058.7);!1-5(3!13.18)與(：-1(3037.4)，(：-3(3029.3)，(：-4(3068.2)和(：-15(3068.9) ;!1-10 0!15.02)與(：-8(5035.6)，(：-120(：17.6)和(：-130025.4) ;以及16-12(5!11.54)與(：-10(3 C125.1)和C-13(SC25.4)的相關(guān)性表明C-4和C-5為環(huán)氧碳，C-11連有兩個(gè)甲基。R0ESY譜中， H-5與H-15和Η-6α，Η_15與Η_3α和H-5,以及Η_3α與H-15的相關(guān)性表明H-5和H-15為α構(gòu)型；H-6β與Η-1的交叉峰表明Η-1為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān) 類(lèi)型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值 與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0026]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn)
[0027] 一、材料和儀器
[0028] 人腎癌RC-2細(xì)胞株購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù)(美國(guó)）。分析純蔗糖購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公 司。重水(D20)購(gòu)于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊(cè)61120購(gòu) 于重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所實(shí)驗(yàn)室。小牛血清、RPMI-1640購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購(gòu)于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質(zhì) 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測(cè)試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)于碧云天生物技 術(shù)研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人批？70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購(gòu)于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武 漢博士德生物有限公司。
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