一種鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的引物、探針及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的引 物、探針及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 很多海洋無脊椎動物，如珊瑚、海葵等，發(fā)現(xiàn)會與一類光合自養(yǎng)的海藻 Symbiodinium(又名蟲黃藻)共生。最近通過分子生物學研究發(fā)現(xiàn)Symbiodinium屬的藻類在 不同的海洋生物宿主中存在生物多樣性，基于分子分類的方法，把Symbiodinium屬分為A-G 屯個類型。其中A-F，G是與造礁珊瑚共生的光合藻類，運些藻類的多樣性分布不僅與宿主的 種類相關(guān)，還與珊瑚礁的群落，地理位置相關(guān)。由于Symbiodinium的群體組成(不同的種類 細胞或個體的豐度)是動態(tài)變化的，通常認為運是Symbiodinium為響應(yīng)環(huán)境變化的生理反 應(yīng)。然而，目前對珊瑚組織中共生的Symbiodinium生理生長特點和與珊瑚宿主的共生關(guān)系 還知之甚少，故而W為一些共生的藻類難W培養(yǎng)，運是對Symbiodinium研究的一個重要難 題。
[0003] 珊瑚健康及白化現(xiàn)象一直是國際國內(nèi)研究的焦點，很多學者一直W來都認為珊瑚 的健康狀態(tài)與共生藻的共生有緊密的關(guān)系，共生藻的"逃跑"或"丟失"被認為是珊瑚疾病或 白化的直接原因。研究發(fā)現(xiàn)珊瑚"白化"現(xiàn)象的發(fā)生與共生的Symbiodinium群體和多樣性動 態(tài)變化息息相關(guān)。比如，由于海水溫度隨季節(jié)性動態(tài)變化，在遇水溫升高的情況下，具有耐 熱性較強的共生藻類的細胞豐度就會出現(xiàn)。目前用于調(diào)查藻類細胞數(shù)量的方法普遍使用人 工顯微鏡下的細胞計數(shù)，該方法費時耗力，實驗誤差大，另外從顯微鏡的形態(tài)學觀察很難鑒 定共生藻的種類、類型。同時在高細胞密度的情況下，是可行的，但如果藻類細胞密度低，就 難W檢測。如何快速，簡單，準確，可靠的檢測海藻類型或者細胞豐度，具有重要的實際運用 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的引物和探針。 [000引為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的引物和探 針，其特征在于，所述引物為SEQ ID NO:2-3,探針為SEQ ID NO:4;
[0006] 或引物為沈Q ID NO:5-6,探針為沈Q ID NO:7;
[0007] 或引物為沈Q ID NO:8-9,探針為沈Q ID NO: 10;
[000引或引物為沈Q ID NO:11-12,探針為沈Q ID NO: 13;
[0009] 或引物為沈Q ID NO:14-15,探針為沈Q ID NO: 16;
[0010] 或引物為SEQ ID NO:17-18,探針為SEQ ID NO: 19;
[0011] 所述探針的5 '端、3 '端均分別用FAM報導(dǎo)巧光染料和TAMRA澤滅基團標記。
[0012] -個方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的試劑盒，其 特征在于，含有所述的引物和探針。
[0013] -個方面，提供所述的試劑盒用于鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的用途。
[0014] -個方面，提供一種用于鑒定珊瑚共生光合藻類快速分裂型的方法，其特征在于， 采用所述引物和探針或所述的試劑盒。
[001引進一步，步驟為，
[0016] 提取光合藻類DNA;
[0017] PCR擴增，采用所述引物和探針；
[001引結(jié)果判定。
[0019] 進一步，所述PCR擴增的程序為:90-100°C，30-60S; 90-100°C，5-30S，50-70°C，20-90s，20~50個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進行巧光信號檢測，巧光模式設(shè)為FAM;澤滅 基團設(shè)為TAMRA。
[0020] 進一步，所述PCR擴增的體系為，1/10體積的10倍PCR反應(yīng)緩沖液，dNTP各0.1~ 0.5mmol/L，Taq DNA聚合酶0.1~5國際單位，探針0.1~0.5mmol/L分離純化的DNA模板液 0.1~化1，上下游引物各0.1~2mmol/L，加無菌去離子水使總體積達到10~10化1。
[0021] 進一步，所述結(jié)果判定為：
[0022] 如果Ct值在0-40之間，優(yōu)選的，Ct值在0-38之間；判定為陽性，表示樣品檢出珊瑚 共生光合藻類的快速分裂型為Clade A;
[0023] 如果Ct值為0或者大于等于40,判定為陰性，表示樣品未檢出珊瑚共生快速分裂型 光合藻類。
[0024] 進一步，還包括根據(jù)標準曲線，依據(jù)Ct值計算出快速分裂型為Clade A的濃度值Y; 所述標準曲線為Y clade A = -0.3098x巧.4468，r2 = 0.9992。
[0025] 所述珊瑚共生快速分裂型的光合藻類Clade A,是指在中國海域，珊瑚共生的光合 藻類Clade A，具有在溫度25°C正常光照培養(yǎng)下，其藻體生長速度及細胞分裂速率遠遠快于 Clade C和Clade F的光合藻類類型，其檢測鑒定特征序列為：
[0026] CAATAGTGGAAGGTCCAAAAGGGACCAATGACGATGGGCAATAGCCAGAACATACACTCTGGGTGCAGCTCCGAGTA CGCCCACTCGCCCATAGCTTCCACTTG。記為沈Q ID N0:1。
[0027] 本發(fā)明主要依據(jù)物種的基因序列特異性，利用運段序列的分子標記可W特異的鑒 定共生光合藻Clade A，同時區(qū)別于非A型的珊瑚共生藻；另外經(jīng)過前期的序列比對及實驗 驗證，通過運段序列GC含量介于45-60 % ;長度介于100-15化P;擴增效率高。同時設(shè)計所得 的引物不易形成二聚體；引物的退火溫度60°C，探針的退火溫度68°CW上，二者相差8°C，探 針適合攜帶巧光標記。故選擇此段序列作為分型鑒定的分子標記。
[0028] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的珊瑚共生快速分裂型的光合藻類Clade A分子檢測 方法，首先是依據(jù)Clade A類型的特征序列，設(shè)計用于實時定量化qman PCR的若干引物和 Taqman探針組合FAM-Clade A。
[0029] 從2014年開始，申請人通過對中國海域珊瑚樣品調(diào)查采樣及Symbiodinium的生物 地理學研究，初步鑒定中國海域珊瑚共生的Symbiodinium常見有Clade A和C兩種類型。通 過不同其培養(yǎng)研究表明，Clade A，F(xiàn)和C在相同的培養(yǎng)狀態(tài)下分裂速率完全不同，Clade A的 分裂速度和生長速度明顯快于Clade C和Clade F。說明Symbiodinium Clade A是快速分裂 的類型，運一發(fā)現(xiàn)可能與珊瑚"白化"或者珊瑚組織的共生藻類豐度的動態(tài)變化密切相關(guān)。 為此，如何對中國海域珊瑚共生光合藻類快速分裂型Symbiodinium Clade A進行快速的檢 測鑒定，對研究珊瑚"白化"機理及其防控防治具有十分重要的意義。
[0030] 為了確保參試藻種為珊瑚共生光合藻類的快速分裂型Clade A，本發(fā)明通過離體 純化培養(yǎng)和口S-PCR方法對所采集的樣品進行了藻類Clade A的鑒定。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明W快速分裂型藻種Clade A的口S序列易變異區(qū)設(shè)計特異引 物和化nMan探針組合(FAM-Clade A)，通過化qman PCR技術(shù)可實現(xiàn)對快速分裂型藻種Clade A的快速定量檢測和細胞快速分裂類型的準確鑒定。進而換算得出共生藻的數(shù)量。
[0032] 本發(fā)明首先通過共生藻的培養(yǎng)實驗，比較各種共生藻的分裂速度，確定A型為快速 分裂性，選擇鑒定A型的意義主要是考慮到快速分裂型共生藻未來可W利用其分裂，生長速 度快的優(yōu)勢，運用于珊瑚的修復(fù)。通過選擇最具有針對A型的特異的DNA位點作為標記，設(shè)計 引物及探針，同時又能準確區(qū)分其他非A型的共生藻，通過前期大量實驗驗證，比較多對探 針引物組合的特異性，另外考慮到引物自身的退火溫度，GC含量，引物長度等綜合因素，本 發(fā)明的引物和探針鑒定A型較為理想，最終達到準確的鑒定區(qū)分A型共生藻的目的。并且充 分利用定量PCR靈敏性特點，需要的共生藻dna攝入量少，對珊瑚組織的取樣量少，不但可W 最大限度減少對珊瑚的破壞，而且可W動態(tài)監(jiān)測珊瑚組織的A型共生藻的數(shù)量變化，探討A 型共生藻與珊瑚健康狀態(tài)的關(guān)系，研究及應(yīng)用價值大。在我國，關(guān)于海洋環(huán)境監(jiān)測的指標及 技術(shù)有很大的缺陷，對珊瑚生活環(huán)境及健康狀態(tài)的評價更是一片空白，對我國珊瑚礁的保 護缺乏法律依據(jù)及相關(guān)標準。本發(fā)明W此目的作為出發(fā)點，通過準確鑒定及定量測定珊瑚 組織內(nèi)共生藻的細胞數(shù)量，從珊瑚共生藻的細胞數(shù)量鑒定及檢測作為一項指標，W此為角 度進而評判珊瑚的健康狀態(tài)，未來有望成為行業(yè)內(nèi)的一項標準。
【附圖說明】
[0033] 圖1是不同藻種培養(yǎng)時間與藻體細胞的光密度吸收關(guān)系圖。