一種抗壞血酸葡萄糖苷結(jié)晶粉末及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物化學(xué)生產(chǎn)領(lǐng)域，具體地說(shuō)設(shè)及一種抗壞血酸葡萄糖巧結(jié)晶粉末及 其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗壞血酸葡萄糖巧，又稱為抗壞血酸葡糖巧、2-0-a-D-化喃葡萄糖基-1^-抗壞血 酸、1^-抗壞血酸-2-葡萄糖巧、心抗壞血酸-2-葡糖武，W下簡(jiǎn)稱AA-2G?？箟难崞咸烟乔墒?迄今人們發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定、性能最佳的心抗壞血酸替代品，在生物體內(nèi)酶的作用下，很容易分 解為D-葡萄糖和VC，具有極高的安全性，主要作為一種美白添加劑應(yīng)用于多種高端品牌化 妝品中，也可作為穩(wěn)定劑、品質(zhì)改良劑、生理活性劑、紫外線吸收劑等用于食品飲料工業(yè)中， 還可作為化學(xué)和醫(yī)藥原料用于醫(yī)藥工業(yè)和保健品領(lǐng)域中。
[0003] 抗壞血酸葡萄糖巧的工業(yè)化生產(chǎn)主要包括制備、純化、結(jié)晶Ξ大工藝。目前生物轉(zhuǎn) 化法是抗壞血酸葡萄糖巧合成的唯一途徑，即利用糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性轉(zhuǎn)糖基作用，將葡 萄糖基供體上的葡萄糖巧轉(zhuǎn)移到VC的2-位C上。反應(yīng)過(guò)程中，VC的2-位C上可能會(huì)連接上長(zhǎng) 短不一的葡萄糖基，產(chǎn)生混合物AA-2Gn(n = 1，2，3，4，5，6)，運(yùn)些寡聚糖基VC衍生物可W通 過(guò)添加糖化酶減少聚合度，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成AA-2G。另外，在糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，易形成AA-5G、AA-6G等AA-2G的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體;且VC和葡萄糖基供體在反應(yīng)后會(huì)有所剩余，因此糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)結(jié) 束后，需對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離純化，最后通過(guò)結(jié)晶的方法，得到高純度的抗壞血酸葡萄糖巧產(chǎn) 品。
[0004] 現(xiàn)已有相關(guān)企業(yè)所生產(chǎn)的抗壞血酸葡萄糖巧產(chǎn)品不僅純度高達(dá)99% W上，且產(chǎn)量 相當(dāng)可觀，我國(guó)對(duì)于抗壞血酸葡萄糖巧的工業(yè)化生產(chǎn)已初見(jiàn)端倪，但仍存在轉(zhuǎn)化率不高，尤 其是底物原料VC的利用率不高、生產(chǎn)成本消耗嚴(yán)重、產(chǎn)物提取收率偏低、排放廢水過(guò)量、環(huán) 境污染嚴(yán)重等諸多問(wèn)題。而抗壞血酸葡萄糖巧本身也存在透光率方面的瑕疵，其濃度大于 20w/v %后，水溶液易呈黃色，影響了該產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種收率高、降低成本的抗壞血酸葡萄糖巧結(jié)晶 粉末的制備方法，本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供前述方法生產(chǎn)獲得的高純度、高結(jié)晶度、高透 光率的抗壞血酸葡萄糖巧結(jié)晶粉末。
[0006] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一種抗壞血酸葡萄糖巧結(jié)晶粉末的 制造方法依次包括如下步驟：
[0007] 轉(zhuǎn)化：用過(guò)量的心抗壞血酸或k抗壞血酸及其鹽與β-環(huán)糊精作為底物，加入環(huán)糊 精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng);再加入糖化酶水解未轉(zhuǎn)化完全的短鏈多糖和剩余的β-環(huán)糊精;最 后加入酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵去除多糖，獲得轉(zhuǎn)化液；
[000引純化:將轉(zhuǎn)化液通過(guò)微濾、一級(jí)納濾、陽(yáng)離子樹(shù)脂、二級(jí)納濾獲得二級(jí)納濾濃液。
[0009]結(jié)晶：將二級(jí)納濾濃液在真空、低溫環(huán)境下連續(xù)濃縮結(jié)晶，離屯、，獲得抗壞血酸葡 萄糖巧晶體；
[0010] 干燥:微波干燥抗壞血酸葡萄糖巧晶體，粉碎后獲得抗壞血酸葡萄糖巧粉末。
[0011] 本發(fā)明所使用的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可W是經(jīng)自然界分離后培育的產(chǎn)酶菌種 獲得，也可W是通過(guò)基因工程手段構(gòu)建的重組菌獲得，還可W通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)獲得，目前市場(chǎng) 銷售的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶已滿足本發(fā)明生產(chǎn)抗壞血酸葡萄糖巧的要求。本發(fā)明所使用 的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶購(gòu)于安琪酵母公司，酶活規(guī)格:90U/mL，產(chǎn)品批號(hào):肥01410211。
[0012] 本發(fā)明所使用的糖化酶又稱為葡萄糖淀粉酶，學(xué)名為α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1， 4-glucan glucohydrolace)，購(gòu)于山東隆科特酶制劑有限公司，產(chǎn)品批號(hào):GA914001306。糖 化酶用于配合環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，水解未轉(zhuǎn)化完全的短鏈糊精，從而提高產(chǎn)率。
[0013] 運(yùn)里需要說(shuō)明的是，本文對(duì)心抗壞血酸、心抗壞血酸及其鹽統(tǒng)稱為"VC"。本發(fā)明優(yōu) 選的底物是k抗壞血酸;底物同樣可W采用k抗壞血酸的鋼鹽形式，但為了保證反應(yīng)的酸 性環(huán)境，W k抗壞血酸鋼作為底物時(shí)必須要同時(shí)加入k抗壞血酸。
[0014] 本發(fā)明所述的制造方法具體來(lái)說(shuō)，包括:所述轉(zhuǎn)化步驟中，投放k抗壞血酸或心抗 壞血酸及其鹽、β-環(huán)糊精后，調(diào)節(jié)抑至4.5~5.5,在適宜溫度下通入氮?dú)鈹埌璺磻?yīng)，直到抗 壞血酸葡萄糖巧濃度為120g/L~140g/L時(shí)停止轉(zhuǎn)化;然后在適宜溫度下加入糖化酶并攬 拌;然后在適宜溫度下調(diào)節(jié)抑至5.0~6.0，加入酵母后，通入空氣攬拌活化，再停止通入空 氣繼續(xù)攬拌;然后加熱滅菌滅酶，放罐獲得轉(zhuǎn)化液。
[0015] 本發(fā)明的底物中，k抗壞血酸或k抗壞血酸及其鹽與β-環(huán)糊精的投放質(zhì)量比為10 ;12~16。其中一種實(shí)施方式是按照k抗壞血酸與β-環(huán)糊精按照質(zhì)量比9:14進(jìn)行投料;另一 種實(shí)施方式是將心抗壞血酸、k抗壞血酸鋼和0-環(huán)糊精按照質(zhì)量比2.5:15:28進(jìn)行投料。
[0016] 其中，所述轉(zhuǎn)化步驟中，1^-抗壞血酸或k抗壞血酸及其鹽和β-環(huán)糊精的攬拌溫度 為35°C~45°C，通入氮?dú)獾募兌萟 99%，連續(xù)攬拌20~26小時(shí)。加入糖化酶時(shí)攬拌溫度上 升到42~50°C，連續(xù)攬拌3~4小時(shí)。加入酵母時(shí)的溫度控制在30~40°C，停止通入空氣連續(xù) 攬拌時(shí)間為8~15小時(shí);然后加熱至60°C滅菌滅酶。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，投入k抗壞血酸和β-環(huán)糊精后，還投入底物質(zhì)量2%~ 10%的抗氧化劑，所述抗氧化劑包括但不限于化HS化、化2S化、化2S2化中任意一種或多種的 組合。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)加入酵母進(jìn)行厭氧發(fā)酵，W去除殘留還原糖。具體的操作是：向反應(yīng)體 系中按lOg/L加入干酵母140kg，通入空氣W好氧形式繼續(xù)攬拌W活化酵母。30分鐘后關(guān)閉 空氣，30~35°C，pH 5.0~6.0，繼續(xù)攬拌8~15h或過(guò)夜。必要時(shí)可檢測(cè)還原糖含量，待含量 不再下降時(shí)即可放罐。經(jīng)過(guò)糖化酶酶解后的還原糖含量約為120~150g/L，經(jīng)酵母消耗后， 其中的還原糖含量可W下降至lOg/L左右，實(shí)際上此時(shí)的還原糖含量已經(jīng)降至Ig/LW下，因 為VC在檢測(cè)葡萄糖的過(guò)程中會(huì)變色導(dǎo)致還原糖的含量在lOg/L左右。經(jīng)過(guò)酵母厭氧發(fā)酵后， 大大減輕后處理的負(fù)擔(dān)。
[0019] 本發(fā)明的核屯、在于純化步驟，利用多級(jí)膜分離技術(shù)去除轉(zhuǎn)化體系中的大分子雜蛋 白、小分子多膚、鹽類和因 VC氧化破壞所產(chǎn)生的色素等，更值得注意的是，通過(guò)對(duì)膜體系的 改善，能將未完全利用的VC進(jìn)行回收和重利用，并可明顯減少分離過(guò)程中產(chǎn)生的廢水排放。 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)葡萄糖基受體VC轉(zhuǎn)化率不高是消耗生產(chǎn)原料成本的主要因素，VC在反應(yīng)過(guò)程中 需要過(guò)量才能得到高產(chǎn)率的抗壞血酸葡萄糖巧。因此本發(fā)明的膜體系除了要實(shí)現(xiàn)基本的純 化要求外，還要控制每個(gè)濾除步驟中抗壞血酸葡萄糖巧和VC的回收率，并實(shí)現(xiàn)VC的再生產(chǎn)， 為此：
[0020] 所述純化步驟中，依次通過(guò)微濾、一級(jí)納濾去除雜質(zhì)、陽(yáng)離子樹(shù)脂，并通過(guò)二級(jí)納 濾截留抗壞血酸葡萄糖巧獲得納濾濃液。
[0021] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，微濾后，向微濾清液中加入酸調(diào)節(jié)抑至3.0~3.5,靜置 后濾除不溶物，再經(jīng)一級(jí)納濾處理，用于后續(xù)的陽(yáng)離子樹(shù)脂處理、濃縮和結(jié)晶步驟;所述酸 包括憐酸、硫酸、鹽酸、草酸、巧樣酸的任意一種。在膜分離過(guò)程中加酸，目的是有效去除轉(zhuǎn) 化過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，W提高產(chǎn)品的透光度。調(diào)酸后所產(chǎn)生的不溶物是轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生 的副產(chǎn)物，若不能及時(shí)去除副產(chǎn)物，將最終影響產(chǎn)品的透光度，進(jìn)而影響成品的品質(zhì)。
[0022] 透過(guò)二級(jí)納濾的溶液進(jìn)一步通過(guò)反滲透獲得至少2.5倍濃度的心抗壞血酸濃液， 并用于后續(xù)生產(chǎn)中轉(zhuǎn)化步驟的原料。所述k抗壞血酸濃液包括k抗壞血酸或其鋼鹽。
[0023] 所述純化步驟中，抗壞血酸葡萄糖巧經(jīng)微濾后回收率為97.0%~99.9%，通過(guò)一 級(jí)納濾后回收率為95.5 %~99.0 %，通過(guò)二級(jí)納濾后回收率為95.5 %~99.0 % ; k抗壞血 酸依次經(jīng)過(guò)微濾、一級(jí)納濾、二級(jí)納濾、反滲透的總回收率不少于75.0%。
[0024] 所述微濾采用的濾膜孔徑大小為20~200nm，可截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍為20萬(wàn)~ 100萬(wàn)道爾頓的物質(zhì)，膜材質(zhì)包括但不限于陶瓷、聚丙締、聚諷、聚偏二氣乙締、醋酸纖維素 薄膜的任意一種。微濾主要用于去除細(xì)菌、雜蛋白、顆粒、黏±等雜質(zhì)。
[0025] 所述一級(jí)納濾采用的濾膜可截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍為200~800道爾頓的物質(zhì)，所 述二級(jí)納濾采用的濾膜可截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍為150~200道爾頓的物質(zhì)，納濾的膜材質(zhì) 為聚酷胺、醋酸纖維素的任意一種。一級(jí)納濾是用于去除分子量較大的多膚、蛋白、色素等 雜質(zhì)，主要在此步驟去除部分色素和無(wú)機(jī)鹽。而二級(jí)納濾則將抗壞血酸葡萄糖巧和VC進(jìn)行 分離。
[0026] 最后通過(guò)反滲透將VC濃縮再利用。所述反滲透采用的濾膜孔徑大小為1~化m，可 截留相對(duì)分子質(zhì)量小于200道爾頓的物質(zhì)，反滲透膜材質(zhì)為聚酷胺、醋酸纖維素的任意一 種。
[0027] 微濾膜的組件類型包括但不限于管式、中空纖維、卷式中的任意一種;納濾和反滲 透膜的組件類型包括但不限于管式、中空纖維、卷式、板框式中的任意一種。微濾膜的操作 壓力小于0.2MPa，納濾膜操作壓力為0.5~3.5MPa，反滲透膜操作壓力為1.5~15MPa;操作 時(shí)膜溫度一般在20°C~50°C之間。
[0028] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述母液經(jīng)精密過(guò)濾器過(guò)濾，目的是有效去除轉(zhuǎn)化過(guò) 程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，W提高產(chǎn)品的透光度:在濃縮結(jié)晶過(guò)程中采用連續(xù)濃縮結(jié)晶方式，不僅 提高了產(chǎn)品的品質(zhì)，同時(shí)提高了產(chǎn)品的收率，提高了工作效率。特別在結(jié)晶過(guò)程中，母液回 收濃縮操作時(shí)，母液經(jīng)過(guò)精密過(guò)濾器過(guò)濾，使得渾濁的雜質(zhì)不斷被分離，保證了濃縮料液的 澄清度;與傳統(tǒng)的先濃縮后降溫結(jié)晶方式相比，連續(xù)濃縮結(jié)晶過(guò)程中雜質(zhì)不斷被分離，提高 了料液的純度。精密過(guò)濾器的濾忍可W選用包括但不限于聚四氣乙締膜(PTFE)濾忍、聚砸 膜化E)濾忍、聚丙締膜(PP)濾忍、醋酸纖維膜(CN-CA)濾忍中的任意一種，優(yōu)選聚四氣乙締 膜濾忍，過(guò)濾精度0.02~50WI1。
[0029] 本發(fā)明微波干燥是將微波功率逐步增加到7~8kW，于40°C干燥10~30min。作為本 發(fā)明的優(yōu)選方案，是在真空度-0.099~-0.096Mpa的環(huán)境中進(jìn)行。真空微波干燥解決了抗壞 血酸葡萄糖巧在后分離過(guò)程中尤其是干燥時(shí)易被氧化而引起的產(chǎn)品色澤褐變。微波穿透的 機(jī)理使熱傳遞在抗壞血酸葡萄糖巧物料中分布更均勻，提高了產(chǎn)品干燥后的水分均一性。 真空微波干燥抗壞血酸葡萄糖巧結(jié)合微波加熱和真空干燥兩項(xiàng)技術(shù)特點(diǎn)，在真空條件下利 用微波能進(jìn)行物料抗壞血酸葡萄糖巧的干燥，真空環(huán)境保證