一種將植物油轉(zhuǎn)化為富含超長鏈高度不飽和脂肪酸的生物油的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于油脂加工處理技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種將植物油轉(zhuǎn)化為富含超長鏈高 度不飽和脂肪酸的生物油的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高度不飽和脂肪酸是指含有Ξ個(gè)或Ξ個(gè)W上雙鍵且碳鏈長度為20個(gè)W上碳原子 的脂肪酸，其中，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于n-3型的高度不飽和脂肪酸具有特別重要的意義，主要 包括二十碳五締酸巧PA)和二十二碳六締酸(DHA)。由于運(yùn)類脂肪酸在高等動(dòng)物(包括人類） 其自身生物合成普遍缺乏，因此，運(yùn)類脂肪酸也被稱為必需脂肪酸，必需通過攝食途徑得到 補(bǔ)充，如果攝入不足，則會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的健康影響。例如，人體中DHA主要分布在大腦灰質(zhì)、神 經(jīng)系統(tǒng)、視網(wǎng)膜細(xì)胞的外節(jié)、屯、肌、精子、嗜酸性白細(xì)胞、母乳等，DHA在細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)腦中樞 神經(jīng)、保護(hù)視力、治療屯、血管疾病、抗腫瘤、抗炎癥、抗過敏等發(fā)揮重要功能;EPA則主要在屯、 血管疾病防控W及肥胖預(yù)防方面有重要作用。同時(shí)，在海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖中，EPA和DHA也是重要 的飼料營養(yǎng)添加劑。因此，如何發(fā)掘高度不飽和脂肪酸的可持續(xù)資源是一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè)應(yīng) 用需求。
[0003] 自然界中，EPA和DHA的主要來源于海洋生物，特別是在深海和寒冷地區(qū)的海洋生 物，其中海洋魚類的脂肪是EPA和DHA的最為重要的傳統(tǒng)資源，但魚油資源有限，純化工藝繁 雜，得率低。
[0004] 從產(chǎn)業(yè)發(fā)展的另外一個(gè)角度來看，植物油資源十分豐富，主要含有十八碳脂肪酸， 而且在產(chǎn)業(yè)中通常會(huì)有大量的過期植物油資源或者地溝油，如果可W將運(yùn)些植物油資源大 量產(chǎn)生新鮮的生物油，則不僅可W產(chǎn)生產(chǎn)業(yè)急需的高度不飽和脂肪酸，而且可W促進(jìn)植物 油加工處理的循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的主要技術(shù)問題是提供一種將植物油轉(zhuǎn)化為富含超長鏈高度不 飽和脂肪酸的生物油的方法，即使用破囊壺菌來利用植物油發(fā)酵產(chǎn)生富含超長鏈高度不飽 和脂肪酸。通過植物油添加的新方法有效促進(jìn)破囊壺菌的生長和油脂積累。
[0006] 本發(fā)明的植物油轉(zhuǎn)化為富含超長鏈高度不飽和脂肪酸的生物油的方法，是將植物 油作為破囊壺菌的培養(yǎng)基成分，通過活體生物的培養(yǎng)，獲得富含超長鏈高度不飽和脂肪酸 的破囊壺菌，經(jīng)過提取，獲得富含超長鏈高度不飽和脂肪酸的生物油。
[0007] 其中的植物油全部或部分用地溝油來替代。
[000引本發(fā)明的方法，其具體步驟如下：
[0009] 1)菌種純化
[0010] 將破囊壺菌在固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15-20°c;
[0011] 其中固體培養(yǎng)基的配方如下:葡萄糖1%，蛋白腺0.15%，酵母提取物0.01%，瓊脂 1%。
[001^ 2脯化培養(yǎng)
[0013] 在步驟1)的培養(yǎng)基平板上選定的菌株區(qū)域添加植物油，將選定的菌株轉(zhuǎn)移到培養(yǎng) 液中，培養(yǎng)溫度為15-20°C，震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為4-7天；
[0014] 培養(yǎng)液的配方如下:葡萄糖1%，蛋白腺0.15%，酵母提取物0.01%，植物油1-2%; [001引 3)快速培養(yǎng)
[0016]將步驟2)的培養(yǎng)液靜置后，吸取表面一層的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液接種到新鮮的液體 培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng);培養(yǎng)溫度為15-30°C，液體培養(yǎng)基起始pH值范圍為4-8,培養(yǎng)時(shí)間為 的天；
[0017]其中液體培養(yǎng)基的配方如下：葡萄糖1%，蛋白腺0.15%，酵母提取物0.01%，植物 油 4-20 %;
[0018] 其中植物油添加的最佳濃度為6-12% ;
[0019] 4)在步驟3)的液體培養(yǎng)基中添加食鹽，使培養(yǎng)液鹽度為45%。-70%。，繼續(xù)培養(yǎng)至菌 體富含超長鏈高度不飽和脂肪酸的生物油；
[0020] 5)從菌體中制備生物油
[0021] 離屯、收集菌體，加入甲醇和氯仿溶液，研磨勻漿后進(jìn)行提取，過濾后在濾液中加入 水，振蕩后靜置分層，將下層有機(jī)溶劑相收集，低溫蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即可得到純化提取 的生物油。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0023] 1、本發(fā)明采用植物作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，可W有效地提高破囊壺菌的生長速度 和油脂累積速度，能夠達(dá)到高度不飽和脂肪酸累積更加高效的積累，相比于傳統(tǒng)方法其效 率可提升20-50%?上；
[0024] 2、本發(fā)明采用植物作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基，所獲得的破囊壺菌生物質(zhì)中所含有的 生物油具有新鮮安全的特點(diǎn)，可W有效促進(jìn)植物油的產(chǎn)業(yè)利用潛力；
[0025] 3、本發(fā)明所獲得的破囊壺菌生物油，經(jīng)過提取或者W生物質(zhì)直接添加的方法，可 W廣泛應(yīng)用于需要EPA和DHA作為食品或飼料添加劑的產(chǎn)業(yè)中。
【附圖說明】
[0026] 圖1破囊壺菌在四種培養(yǎng)基中的生長曲線圖；
[0027] 圖2:破囊壺菌在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的呼吸量測(cè)定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明所用的植物油是指市售的植物油，包括花生油、菜巧油、大豆油等，運(yùn)些植 物油中通常含有C16脂肪酸和C18脂肪酸，其中不飽和脂肪酸脂肪酸主要是C18:2和C18:3。 地溝油是指經(jīng)過工業(yè)回收凈化處理的廢棄植物油，運(yùn)樣的產(chǎn)品大量存在，如果能夠?qū)⑵渥?為微生物培養(yǎng)基，獲得新鮮的富含生物油的新原料，那么就可W使廢棄植物油(地溝油)得 到更加安全的保證。上述兩種原料通常都不含有超長鏈高度不飽和脂肪酸，因此，如果能夠 將其作為微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基，通過微生物自有的生物合成途徑從而獲得超長鏈高度不飽 和脂肪酸，是本發(fā)明的主要目的。
[0029] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0030] 實(shí)施例1:
[0031] 1.菌種純化
[0032] 將破囊壺菌在蛋白腺、酵母提取粉、葡萄糖培養(yǎng)基下固體培養(yǎng)基平板上，劃線，選 擇生長速度快的菌落進(jìn)行純化。100ml培養(yǎng)基的配方:葡萄糖1%，蛋白腺0.15%，酵母提取 物0.01 %，瓊脂1 %。培養(yǎng)溫度為20°C，靜止培養(yǎng)。
[0033] 2.活化培養(yǎng)
[0034] 在上述平板上選定的區(qū)域添加1小滴植物油，用移液槍吸取，并轉(zhuǎn)移到lOOmlS角 燒瓶，每100ml培養(yǎng)液中含葡萄糖1 %，蛋白腺0.15%，酵母提取物0.01 %，植物油1-2% ;培 養(yǎng)溫度為15-20°C，震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天。
[00巧]3.快速培養(yǎng)
[0036] 上述培養(yǎng)液靜置30分鐘后，吸取表面一層液體，大致30ml的接種液，取數(shù)瓶，W1: 20的接種比例，將接種液添加至新鮮的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移到lOOO-lOOOOml燒瓶或其 他培養(yǎng)容器中。每100ml培養(yǎng)液中含葡萄糖1 %，蛋白腺0.15%，酵母提取物0.01 %，植物油 4-8%。放置在搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速快，轉(zhuǎn)速為100-18化pm，或者充氣培養(yǎng)。溫度高，培養(yǎng)溫度為30 °C，起始pH值范圍為4.5，培養(yǎng)時(shí)間為6天。
[0037] 通過W上培養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn)破囊壺菌可W在含植物油的GYP培養(yǎng)中生長，且有促進(jìn)作 用。
[0038] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在兩種經(jīng)典的培養(yǎng)基500mL中，如果添加 20mL植物油，均可W高效 促進(jìn)破囊壺菌的生長速度，在培養(yǎng)周期為6天的培養(yǎng)過程中，對(duì)于GYP培養(yǎng)基(葡萄糖、酵母、 蛋白腺）來說，添加植物油可W使生物量增加1倍W上，而對(duì)于YP培養(yǎng)基(酵母、蛋白腺）來 說，添加植物油可W使生物量增加至約5倍。由此實(shí)驗(yàn)可W判定，植物油的添加可W高效地 促進(jìn)破囊壺菌的生長速度，從而達(dá)到更高的生物量的累積(圖1);其中培養(yǎng)基組成如下：
[0039] YP: 1 %酵母提取物，1 %蛋白腺，海水500ml
[0040] GYP: 2 %葡萄糖，1 %酵母提取物，1 %蛋白腺，海水500ml
[0041 ] GYP020:2%葡萄糖，1%酵母提取物，1%蛋白腺，海水500ml，植物油20ml YP020:， 1 %酵母提取物，1 %蛋白腺，海水500ml，植物油20ml
[0042] 實(shí)施例2:
[0043] 1.收集實(shí)施1所獲得的破囊壺菌的生物質(zhì)，所采用的培養(yǎng)基有W下四種:YP，GYP， GYP0,YP0(G指葡萄糖，Y指酵母提取物，P指蛋白腺，0指植物油），其中YP 020指500mLYP0培 養(yǎng)基中加入20mL植物油，W此類推。
[0044] 2.生物油的提取方法采用Bligh-Dyer法，稱取Ig待測(cè)樣品，加入10ml甲醇，加少量 酸洗砂研磨，勻漿1分鐘，然后加入20ml氯仿，繼續(xù)勻漿2分鐘，過濾，濾渣中加入氯仿-甲醇 混合液(2: lv/v)30ml并研磨，過濾。先用20ml氯仿及10ml甲醇洗涂濾渣，合并濾液，然后加 入全部濾液體積1/4的水，振蕩，靜置分層，將上層及界面處固體物吸除去，然后加入甲醇-水混合物（1:1 )，體積為下層體積的1/4，振蕩，靜置分層，吸掉上層液體及界面物，重復(fù)洗涂 兩次。然后將有機(jī)相減壓蒸干，配制成氯仿溶液，-20°C下保存。
[0045] 3.脂肪酸的GCMS樣品制備：取約4mg的總脂，加入約1ml 1.5 %的化OH/MeOH，在55 °C水浴中加熱30分鐘，然后加入1.5ml肥1/MeOH，水浴加熱30分鐘，加0.5ml左右的蒸饋水， 然后用4ml正己燒萃取，吸取正己燒層，重復(fù)兩次。然后將萃取液減壓蒸干，加入0.3ml氯仿。
[0046] 4.脂肪酸的GCMS分析
[0047] 儀器:QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀，帶A0C-20自動(dòng)進(jìn)樣器舊本Shimadzu公司）， 30mX0.25mmX0.25μηι SPB-50色譜柱(美國Supelco公司）。
[004引 GC條件:進(jìn)樣口溫度250°C，載氣純度為99.999 %高純氮，柱流速1.05ml/min，柱前 壓73. OkPa，分流進(jìn)樣，分流比50:1。
[0049