的復(fù)合物進(jìn) 行分子動(dòng)力學(xué)模擬前準(zhǔn)備。HLA-A2.1的初始坐標(biāo)來(lái)自于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)專屬網(wǎng)站http:// WWW.rcsb.org/pdb/，將獲得的HLA-A2.1結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)導(dǎo)入MOE軟件中，依次選擇下拉菜單 Applications-Docking Suite-Docking Ligands，出現(xiàn)Docking對(duì)話框，在Filename欄的右 邊選擇Def ine對(duì)HLA-A2.1結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接前結(jié)構(gòu)修飾(修復(fù)側(cè)鏈，脫水加氫），結(jié)構(gòu)修飾完成 后分析獲得HLA-A2.1的結(jié)合槽凹槽三維信息，保存以備與表位肽進(jìn)行對(duì)接。（3)對(duì)接模型的 構(gòu)建。在MOE軟件中依次打開Applications-Docking Suite-Docking Ligands，出現(xiàn) Docking對(duì)話框，在Docking Mode和Filename欄選擇獲得的HLA-A2.1的結(jié)合槽凹槽三維信 息，在Ligand Sourse欄中選擇Mole 2File并選擇M0L2格式的各個(gè)已經(jīng)優(yōu)化并處于能級(jí)最 低的表位肽數(shù)據(jù)，分別進(jìn)行對(duì)接并最終得到對(duì)接模擬的評(píng)分，通過(guò)對(duì)接模擬的評(píng)分值對(duì)表 位肽分子和HLA-A2.1的結(jié)合力做預(yù)估，由于抗原肽與MHC分子之間主要通過(guò)疏水作用、H鍵、 鹽鍵等弱相互作用進(jìn)行分子間的識(shí)別，這些次級(jí)鍵作用越強(qiáng)，結(jié)合則越緊密。計(jì)算機(jī)模擬結(jié) 果顯示，E1，E22條表位肽與HLA-A2.1均能很好的結(jié)合(如圖2、4)。
[0044] 3、T2親和力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表位肽與人MHC-I類分子的結(jié)合：
[0045]本實(shí)施例利用Τ2細(xì)胞系的特點(diǎn)，檢測(cè)表位肽與人MHC-I類分子的親合力。Τ2細(xì)胞可 表達(dá)MHC-I類分子，但因其內(nèi)源性抗原呈遞途徑中必需的抗原多肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TAP)缺陷，故 不能轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性抗原，只能將空載的HLA-A2分子呈遞在細(xì)胞表面，而空載的HLA-A2分子在 細(xì)胞表面不穩(wěn)定，很快降解或返回細(xì)胞內(nèi)部。但外源給與的抗原多肽與HLA-A2分子結(jié)合成 復(fù)合物后，可增強(qiáng)細(xì)胞表面HLA-A2分子的穩(wěn)定性，而留在細(xì)胞表面?？乖呐cHLA-A2的結(jié)合 力越強(qiáng)，則T2細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達(dá)量就越高。所以檢測(cè)抗原多肽處理的T2細(xì)胞表面 HLA-A2分子表達(dá)量的增加，可直觀地反映外來(lái)抗原多肽與HLA-A2分子的結(jié)合力以及結(jié)合的 穩(wěn)定性，能夠進(jìn)一步證明本發(fā)明的多肽的有效性。
[0046] 實(shí)施例中，T2細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次，以無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基重懸后，在6孔培養(yǎng)板上按1 X 1〇6/孔的密度種植，各抗原多肽以二甲基亞砜(DMSO)溶解后，以50μg/ml的濃度加入到T2 細(xì)胞的培養(yǎng)液中，并設(shè)置空白對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組加入30μg/ml流感病毒基質(zhì) 蛋白多肽。各孔均加入3μg/mlAi3 2微球蛋白。T2細(xì)胞在37°C，5 %⑶2、飽和濕度條件下培養(yǎng) 24h后。孵育結(jié)束后，T2細(xì)胞以1000 rpm離心5min，沉淀細(xì)胞以冰I 3BS洗滌3次，然后以100μΙ冰 PBS重懸，加入5μ1鼠抗人HLA-A2.1-FITC單抗，4°C孵育15min，離心棄上清后以300μ1冰PBS 重懸，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度(MFI)。表3所示即為表位肽與MHC-I分子的親和力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0047] 結(jié)果以熒光系數(shù)(FI)作為衡量指標(biāo)，計(jì)算公式為:熒光系數(shù)(FI) = (多肽平均熒光 強(qiáng)度_β2微球蛋白平均熒光強(qiáng)度)/β2微球蛋白平均熒光強(qiáng)度，判斷標(biāo)準(zhǔn):FI>1.5為多肽與 HLA-A2 · 1分子結(jié)合力高，1 · 0〈FI〈1 · 5為中等結(jié)合力，F(xiàn)I>0 · 5為低結(jié)合力。
[0048] 表3表位肽與MHC-I分子的親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0050]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：兩個(gè)表位肽El和E2與MHC-I類分子均有很高的結(jié)合力。
[0051 ] 實(shí)施例二
[0052]表位肽的合成、純化及分子量測(cè)定：
[0053]采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，應(yīng)用美國(guó)PE公司生產(chǎn)的ABI43IA型多肽合成儀進(jìn)行多肽的合 成，簡(jiǎn)述如下：按照多肽序列使肽鏈從羧基端向氨基端延伸，合成后，選用TFA/DCM進(jìn)行切 害J，表位肽收集液在常溫下減壓干燥至l-2mL，然后用至少50mL預(yù)冷乙醚沉淀，然后抽濾，得 到的多肽粗產(chǎn)品。將獲得的表位肽粗品用少量DMSO溶解后，用水稀釋至所需體積，濃度為 1〇11^/1]11^，經(jīng)0.22以1]1纖維膜過(guò)濾后，在美國(guó)￥3丨6^公司產(chǎn)品〇6]^600型即]^上純化并進(jìn)行純 度分析。流動(dòng)相選用含0.1 %TFA水溶液和含0.1 %TFA乙氰溶液。各肽的純化選用C18制備柱 (美國(guó)Water s公司，7. Ομπι，100A，7.8mm X 150mm)，各肽的純度分析選用C18分析柱（美國(guó) Waters公司，5·0μπι，100Α，3·9πιπιΧ 150mm)。各純化后多肽的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定在API 2000 型(美國(guó)Waters公司）質(zhì)譜儀上安常規(guī)方法進(jìn)行。其質(zhì)譜分析圖參見(jiàn)圖5、圖7，HPLC分析圖參 見(jiàn)圖6、圖8,可以看出2條多肽的分子量理論值均與實(shí)測(cè)值相近，在允許誤差范圍之內(nèi)，且純 度均在95%以上，說(shuō)明合成效果好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。上述多肽經(jīng)凍干處理后放于-70°C 保存、備用。
[0054] 實(shí)施例三
[0055] 鈣黃素 (Calcein-AM)釋放實(shí)驗(yàn)表位肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向免疫殺傷效果：
[0056] 1、效應(yīng)細(xì)胞的制備
[0057] 誘導(dǎo)成熟的人DC細(xì)胞，以I3BS清洗后，無(wú)血清頂DM培養(yǎng)基重懸，加50μg/ml表位肽， 37°C孵育過(guò)夜。DC細(xì)胞經(jīng)PBS清洗、計(jì)數(shù)，按30μg/ml的濃度加入絲裂霉素 C，37°C孵育30min。 DC細(xì)胞經(jīng)冰PBS清洗、計(jì)數(shù)后，與繁殖期T細(xì)胞按1:20比例共培養(yǎng)，并加入50U/ml的IL-2,以 刺激T細(xì)胞。1周刺激1次，共3次，將T細(xì)胞誘導(dǎo)成細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，即效應(yīng)細(xì)胞。
[0058] 2、靶細(xì)胞的制備
[0059] 復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞MCF7、MBA-MD-231和人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63、U-20S，正常培養(yǎng)、傳 代。其中MCF7、MG-63兩細(xì)胞株為HLA-A2.1陰性，MBA-MD-231、U-20S兩細(xì)胞株為HLA-A2.1陽(yáng) 性。
[0060] 3、鈣黃素釋放實(shí)驗(yàn)
[0061] 以IOmM濃度的Calcein-AM標(biāo)記靶細(xì)胞，清洗、重懸;效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記后的腫瘤細(xì)胞 按照1:1、10:1、20:1、40:1、80:1的效靶比例，37°C共培養(yǎng)4h;然后收集培養(yǎng)液，1000 rpm離心 5min，取100μΙ上清液測(cè)定平均熒光強(qiáng)度，以單純靶細(xì)胞作為自發(fā)釋放量，以單純靶細(xì)胞加 去垢劑作為最大釋放量。
[0062] 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率以細(xì)胞溶解率表示:細(xì)胞溶解率=(實(shí)驗(yàn)釋放量-自發(fā) 釋放量)/(最大釋放量-自發(fā)釋放量）。表4即為表位肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺 傷結(jié)果。
[0063] 表4表位肽誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷百分率（％ )
[0064]
[0065]注:殺傷作用以殺傷率（％已省略)表示。
[0066] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Ε1、Ε2兩條多肽對(duì)HLA-A2陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231和人骨 肉瘤細(xì)胞U-20S均具有殺傷作用;Ε1、Ε2對(duì)HLA-A2陰性的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人骨肉瘤細(xì) 胞MG-63殺傷作用不明顯，殺傷具有MHC-I分子的限制性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于:能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn) 進(jìn)行結(jié)合，可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表位肽，2條表位肽具有下列氨基酸序列 為： El，Tyr lie Met Phe Val Asp Pro Ser Leu； E2，Tyr Leu Val Ala Leu Ser Tyr Thr Leu〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于:所述的與 人MHC-I類分子結(jié)合的表位肽，為具有該氨基酸序列的游離型多肽、融合型多肽和嵌合型多 肽；以及以上所述2種多肽之一為單體的各種形式的聚合體。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：所述的 MHC-I類限制性靶向抗腫瘤CTL表位肽可通過(guò)人工合成，或通過(guò)原核細(xì)胞或真核細(xì)胞表達(dá)純 化獲得。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：所述的 MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽根據(jù)表位肽與MHC-I類分子相互作用的機(jī)理，預(yù)測(cè)獲得表 位肽，并根據(jù)其能有效與MHC-I類分子結(jié)合并能激活特異性T淋巴細(xì)胞的特性鑒定為有效的 表位肽，該表位肽長(zhǎng)度僅9個(gè)氨基酸序列，體外容易合成，方便臨床應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于：所述的 MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽所涉及的表位肽與功能或性質(zhì)已知的蛋白質(zhì)融合或嵌合， 即這些蛋白質(zhì)分子或嵌合分子包含了本發(fā)明涉及的多肽氨基酸序列，具有這些多肽的相同 或相似活性。
【專利摘要】一種MHC-I類限制性抗腫瘤CTL表位肽，能與人MHC-I類分子的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，可激活特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的表位肽，2條表位肽具有下列氨基酸序列為：E1，Tyr？Ile？Met？Phe？Val？Asp？Pro？Ser？Leu；E2，Tyr？Leu？Val？Ala？Leu？Ser？Tyr？Thr？Leu；所述的與人MHC-I類分子結(jié)合的表位肽，為具有該氨基酸序列的游離型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述2種多肽之一為單體的各種形式的聚合體。該發(fā)明使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，提高表位肽篩選的準(zhǔn)確性，多肽物質(zhì)僅為9肽的短肽，體外容易合成，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著抗腫瘤免疫反應(yīng)，具有非常大的商業(yè)產(chǎn)業(yè)化價(jià)值，應(yīng)用于腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域中。
【IPC分類】A61P35/00, C07K7/06
【公開號(hào)】CN105504015
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610076778
【發(fā)明人】魏敏杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年2月2日