專利名稱：：Hla-a*3303限制性wt1肽和包含此肽的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及HLA-V3303限制性肽，具體地說所述肽包含由來自WT1蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp,并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。此外，本發(fā)明還涉及編碼此肽的多核苷酸和包含此肽的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。
背景技術(shù)：
：WT1基因(Wilms腫瘤1基因(Wilms'tumor1gene))被認(rèn)為是導(dǎo)致Wilms腫瘤即兒童腎癌的基因(非專利文獻(xiàn)1和2)。WT1是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。WT1基因起初被認(rèn)為是腫瘤阻抑基因。然而隨后的研究(非專利文獻(xiàn)3、4、5和6)表明WT1基因在造血腫瘤和實(shí)體癌中起癌基因的作用。WT1基因在許多類型的惡性腫瘤中高水平表達(dá)。對(duì)作為自體蛋白的未突變WT1基因產(chǎn)物在活體中是否具有免疫原性已做了驗(yàn)證。這些結(jié)果表明了在腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)的WT1基因所表達(dá)的蛋白經(jīng)過在細(xì)胞內(nèi)的加工而被片段化。產(chǎn)生的肽和MHCI類分子形成復(fù)合體，該復(fù)合體被呈遞到細(xì)胞表面，通過肽的接種可以-漆導(dǎo)識(shí)別該復(fù)合體的CTL(非專利文獻(xiàn)7、8和9)。同樣表明用WT1肽或WT1的cDNA免疫小鼠，被移植的表達(dá)WT1基因的腫瘤細(xì)胞被高幾率地排斥(非專利文獻(xiàn)7和10);而生理性地表達(dá)WT1基因的正常組織沒有受到凈皮誘導(dǎo)的CTL的破壞(非專利文獻(xiàn)7)。體外人類細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)具有結(jié)合HLA-V0201分子(人類MHCI類分子之一)的高能力的Dbl26肽或WH187肽(SEQIDNo:1的第187-195位的氨基酸，SLGEQQYSV)用于刺激具有HLA-A*0201的人類外周血單核細(xì)胞時(shí)，WTl-特異性CTL被誘導(dǎo)。被誘導(dǎo)的CTL具有對(duì)高水平地內(nèi)源表達(dá)WTl基因的腫瘤細(xì)胞特異的細(xì)胞毒活性，該CTL的細(xì)胞毒活性是HLA-A2限制性的(非專利文獻(xiàn)11)。人類細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)表明使用匹配HLA-A^402(其是HLA-A等位基因之中最頻繁地出現(xiàn)在日本人中的)的WTl肽(WT1235;SEQIDNo:1的第235-243位的氨基酸，CMTWNQMNL),可以誘導(dǎo)WTl特異性CTL(TAK-1)(非專利文獻(xiàn)12)。被誘導(dǎo)的CTL并不阻抑部分地生理表達(dá)WTl基因的正常造血干細(xì)胞形成集落的活性。這些報(bào)道強(qiáng)烈地表明WTl特異性CTL不止可以在小鼠中誘導(dǎo)而且可以在人類中誘導(dǎo)。此CTL具有抗高水平表達(dá)WTl基因的胂瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，但不具有抗生理地表達(dá)WTl基因的正常細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。(非專利文獻(xiàn)7、10、11、12、13和14)。WTl基因產(chǎn)物作為核內(nèi)蛋白被呈遞并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)蛋白酶體加工而片段化成肽。片段化的肽被TAP(與抗原加工有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，與MHCI類分子形成復(fù)合體并呈遞到細(xì)胞表面。出于CTL前體細(xì)胞經(jīng)由TCR而識(shí)別WTl肽-MHCI類分子復(fù)合體的結(jié)果，WTl特異性CTL被誘導(dǎo)，從而施加細(xì)胞毒的作用于通過MHCI類分子呈遞WT1基因產(chǎn)物的腫瘤細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)7、8和9)。那么，定靶WTl基因產(chǎn)物的癌癥免疫療法中所使用的WTl肽至少需要是在活體中結(jié)合MHCI類分子的形式。然而MHCI類分子是多種多樣的而且結(jié)合各自的MHCI類分子的WTl肽的氨基酸序列也是互不相同的。因此，需要提供與各自的MHCI類亞型匹配的肽。然而，迄今僅知道HLA-A*2402分子限制性肽、HLA-A*0201分子限制性肽和HLA-A*2601分子限制性肽是HLA分子限制性的WTl肽(分別見專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)11和專利文獻(xiàn)2)。HLA-A*3303以緊隨HLA-A^2402之后的最高百分比出現(xiàn)在日本人中。因此，有必要找出HLA-A、303限制性的WT1肽。專利文獻(xiàn)l:WO2003/106682專利文獻(xiàn)2:WO2005/095598非專利文獻(xiàn)1:DanielA.Haber等.，Cell.1990Jun29;61(7):1257-69.非專利文獻(xiàn)2:CallKM等.，Cell.1990Feb9;60(3):509-20.非專利文獻(xiàn)3:MenkeAL等.，IntRevCytol.1998;181:151-212.綜述.非專利文獻(xiàn)4:YamagamiT等.，Blood.1996Apr1;87(7):2878-84.'非專利文獻(xiàn)5:InoueK等.，Blood.1998Apr15;91(8):2969-76.非專利文獻(xiàn)6:TsuboiA等.，LeukRes.1999May;23(5):499-505.非專利文獻(xiàn)7:OkaY等.，JImmunol.2000Feb15;164(4):1873-80.非專利文獻(xiàn)8:MeliefCJ等"ImmunolRev.1995Jun;145:167-77.非專利文獻(xiàn)9:RitzJ,JClinOncol.1994Feb;12(2):237匿8.非專利文獻(xiàn)10:TsuboiA等.，JClinImmunol.2000May;20(3):195-202.非專利文獻(xiàn)11:OkaY等.，Imm腦genetics.2000Feb;51(2):99-107.非專利文獻(xiàn)12:OhminamiH等.，Blood.2000Jan1;95(l):286-93.非專利文獻(xiàn)13:GaoL等"Blood.2000Apr1;95(7):2198隱203.非專利文獻(xiàn)14:OhminamiH等.，Blood.2000Jan1;95(l):286-93.發(fā)明公開本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明要解決的問題是提供HLA-A、303限制性的WT1肽和編碼此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苦酸的用于治療/預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。解決問題的方法本發(fā)明人針對(duì)以上描述的情況做了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具以下特征的肽能夠高效誘導(dǎo)WT1特異性CTL:包含由來自WT1蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp并且在氨基酸序列中第9位的M酸是Arg。因此，本發(fā)明已被完成。本發(fā)明提供(1)包含由來自WT1蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp并且在氨基酸序列中第9位氨基酸的是Arg;(2)(1)中的肽，其中氨基酸序列選自LeuSerHisLeuGinMetHisSerArg(SEQIDNo:2)、PheSerArgSerAspGinLeuLysArg(SEQIDNo:3)、SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4)和ThrSerGluLysProPheSerCysArg(SEQIDNo:5);(3)(2)中的肽，其中氨基酸序列是SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4);(4)用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含(l)中的肽；(5)用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括對(duì)HLA-A+3303陽(yáng)性受試者施用有效量的(4)中的藥物組合物；(6)(l)中的肽在制備(4)中的藥物組合物中的應(yīng)用；(7)編碼(l)中的肽的多核苷酸；(8)包含(7)中的多核苷酸的表達(dá)載體；(9)用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含(7)中的多核苷酸或者(8)中的載體；(10)治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的(9)中的藥物組合物給予HLA-A、303陽(yáng)性受試者。(11)(7)中的多核苷酸或(8)中的載體在制備(9)中的藥物組合物中的應(yīng)用；(12)WT1特異性CTL,其可通過(l)中的肽i秀導(dǎo)；(13)用于誘導(dǎo)WT1特異性CTL的方法，所述方法包括在(l)為WT1特異性CTL;(14)用于誘導(dǎo)WT1特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的(l)中的肽；(15)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞，.其可通過(l)中的肽誘導(dǎo)；(16)-誇導(dǎo)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在(l)中的肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞使之從未成熟的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)成為呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞；(17)誘導(dǎo)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的(l)中的肽；(18)用于診斷癌癥的方法，所述方法包括使用(12)中的CTL或者(15)中的抗原呈遞細(xì)胞；(19)用于測(cè)定WT1特異性CTL在HLA-A*3303陽(yáng)性受試者中存在或量的方法，所述方法包括(a)使WT1肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體與來自受試者的樣品反應(yīng)；(b)測(cè)定識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL的存在或量；(20)(19)中的方法，其中所述復(fù)合體是四聚體的形式。發(fā)明效果本發(fā)明提供了HLA-A*3303限制性WT1肽、編碼此肽的多核苷酸以及包含此肽和此多核苷酸的用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物等等。因此有可能在具有HLA-A*3303的受試者的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)WT1特異性CTL。因?yàn)榧s24%的日本人具有至少一個(gè)HLA-A*3303分子，所以可以在非常廣范圍的受試者中誘導(dǎo)WT1特異性CTL。附圖簡(jiǎn)述圖1代表用\￥11337誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖2代表用WTl364誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖3代表用WT1，誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖4代表用WTUo9誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性。圖5代表用WTl364誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖6代表用WTl367誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖7代表用WTUo9誘導(dǎo)CTL的抗內(nèi)源表達(dá)WT1基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。圖8代表用WTl367誘導(dǎo)CTL的抗表達(dá)WTl基因的細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式人類WTl蛋白的氨基酉踏列示于SEQIDNo:1。WT1基因以其天然的形式高水平地表達(dá)于例如，諸如白血病、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome)、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤中以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌中。此外對(duì)HLA-A*3303的錨定基序的特征為第2位的氨基酸是Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp中的任意一個(gè)并且第9位的氨基酸是Arg。因此另一方面，本發(fā)明涉及HLA-A'3303限制性WT1肽，所述肽包含由來自WT1蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸優(yōu)選選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸優(yōu)選Arg(下文稱為肽)。本發(fā)明的肽所包含的由9個(gè)氨基酸組成的氨基酸序列優(yōu)選是LeuSerHisLeuGinMetHisSerArg(SEQIDNo:2)、PheSerArgSerAspGinLeuLysArg(SEQIDNo:3)、SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4)或者ThrSerGluLysProPheSerCysArg(SEQIDNo:5)。最優(yōu)選是SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4)。此外，在SEQIDNo:2-5中任一個(gè)的9個(gè)氨基酸中，可以用其他氨基酸代替一個(gè)至多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)至五個(gè)氨基酸。可以適當(dāng)?shù)匦揎?個(gè)氨基酸的任意一個(gè)或者其他代替的氨基酸。在任何情況下本發(fā)明的肽保持結(jié)合HLA-A、303分子的能力。如前文所述，本發(fā)明的目的是要獲得HLA-A*3303限制性WTl肽。因此，本發(fā)明的肽可以是任何一種，只要此肽包含來自WT1蛋白的氨基酸序列并且是由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成。因此，本發(fā)明的肽可以是例如僅由在SEQIDNo:2-5的任意一個(gè)中所表示的氨基酸序列的肽、包含在SEQIDNo:2-5的任意一個(gè)中所表示的氨基酸序列的WTl蛋白或其部分?？梢栽诒景l(fā)明的肽中由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列的N-末端和/或C-末端連接各種物質(zhì)。例如可以連接氨基酸、肽或者所述的氨基酸或肽類似物。倘若使這些物質(zhì)連接到本發(fā)明的肽，則它們可以被力口工，例如通過活體中的酶或者通過諸如細(xì)胞內(nèi)加工的加工過程，最后可以產(chǎn)生此由9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列并與HLA-A*3303分子作為復(fù)合體被呈遞到細(xì)胞表面，從而達(dá)到誘導(dǎo)CTL的效果。這些物質(zhì)可以是調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的溶解性的物質(zhì)或者是增加所述肽的穩(wěn)定性(對(duì)蛋白酶的抗性等等)的物質(zhì)?；蛘哌@些物質(zhì)可以是特異性地傳遞本發(fā)明的肽的物質(zhì)，例如傳遞到特定的組織或者器官；或者它們可以具有提高被抗原呈遞細(xì)胞攝取效率的作用等等。這些物質(zhì)可以是諸如輔助肽等能提高誘導(dǎo)CTL能力的物質(zhì)。本發(fā)明的肽可以通過在本領(lǐng)域中所使用的一般的方法或其修改形式合成。所述方法描述于例如PeptideSynthesis(肽合成)，Interscience,NewY或k(紐約)，1966、ThePpteins(蛋白)，Vol2(第2巻)，AcademicPressInc.(學(xué)術(shù)出版社公司)，NewYork(紐約)，1976、Peptide-Gosei,MaruzenCo.,Ltd.(Maruzen有限公司)，1975、Peptide-GoseiNoKisoToJikken，MaruzenCo.，Ltd.(Maruzen有卩艮乂^司)，1985和IyakuhinNoKaihatsu(Zoku),Vol.14(第14巻),，Peptide-Gosei，Hirokawa隱Bookstore(Hirokawa書店)，1991。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含HLA-A、303限制性WTl肽。WTl基因高水平地表達(dá)于例如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤中以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌中。因此本發(fā)明的藥物組合物可以應(yīng)用于治療或預(yù)防癌癥。當(dāng)將本發(fā)明的藥物組合物給予HLA-A、303陽(yáng)性受試者時(shí)，WT1特異性CTL被包含在藥物組合物中的HLA-A*3303限制性WT1肽所誘導(dǎo)，并由這種CTL破壞受試者的癌細(xì)胞。除作為有效成分的HLA-A、303限制性WT1肽以外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含例如載體、賦形劑等。包含在本發(fā)明的藥物組合物中的HLA-A、303限制性WT1肽誘導(dǎo)WT1特異性CTL。因此起給藥以增強(qiáng)誘導(dǎo)效果。優(yōu)選佐劑的實(shí)例包括但不限于完全的或不完全的弗氏佐劑和氬氧化鋁。本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)刈鞒鲞x擇例如疾病類別、受試者的狀態(tài)或耙位點(diǎn)。所述方法的實(shí)例包括但不限于皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、靜脈給藥、鼻內(nèi)給藥以及口腔給藥。包含在本發(fā)明的藥物組合物中肽的含量，以及本發(fā)明的藥物組合物的劑型、給藥次數(shù)等等可以根據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)刈鞒鲞x擇例如疾病類別、受試者的狀態(tài)或靶位點(diǎn)。肽的單次劑量通常是O細(xì)lmg-1000mg，優(yōu)選0.001mg-10000mg。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的藥物組合物給予HLA-A'3303陽(yáng)性受試者。待治療或預(yù)防的癌癥可以是任何一種，其實(shí)例包括諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌。另一方面，本發(fā)明涉及HLA-A*3303限制性WT1肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明涉及用于測(cè)定WT1特異性CTL在HLA-A*3303陽(yáng)性受試者中的存在或量的方法，所述方法包括(a)使WT1肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體與來自受試者的樣品反應(yīng)；(b)測(cè)定識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL的存在或量。取自受試者的樣品可以是任何一種，只要樣品中有可能含有淋巴細(xì)胞。樣品的實(shí)例包括諸如血液或淋巴的體液和組織。WT1肽和HLA-A、303分子的復(fù)合體可以按以下方式制備例如使用諸如生物素-鏈霉親和素法的本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備為四聚體或者五聚體。識(shí)別此復(fù)合體的CTL的存在或量可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法檢測(cè)。本發(fā)明的此方面中，此復(fù)合體可以-故標(biāo)記。諸如熒光標(biāo)記或者放射性標(biāo)記的眾所周知的標(biāo)記可以用作標(biāo)記。通過標(biāo)記使CTL存在或量的測(cè)定簡(jiǎn)易快速。本發(fā)明的此方面的方法可以用于診斷癌癥、預(yù)測(cè)癌癥等等。因此本發(fā)明同樣提供了用于測(cè)定WT1特異性CTL在HLA-A*3303的陽(yáng)性受試者中的存在或量的組合物，所述組合物包含WT1肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。此外本發(fā)明提供了用于測(cè)定WT1特異性CTL在HLA-A*3303的陽(yáng)性受試者中的存在或量的試劑盒，所述試劑盒包含WT1肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。因此本發(fā)明同樣涉及WT1特異性CTL,其可通過使用WT1肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體產(chǎn)生WTl特異性CTL的方法獲得。此外本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生WTl特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含WTl肽與HLA-A*3303分子的復(fù)合體。另一方面，本發(fā)明涉及編碼HLA-A*3303限制性WTl肽的多核苷酸(下文稱為WTl多核苷酸)。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA或RNA。本發(fā)明的多核苷酸的堿基序列可以基于HLA-A*3303限制性WTl肽的氨基酸序列而確定。所述多核苷酸可以通過例如合成DNA或RNA的方法、PCR法等方法制備。另一方面，本發(fā)明涉及包含此多核苦酸的表達(dá)載體(下文稱為WTl表達(dá)載體)。表達(dá)載體的類別、所包含的除此多核苷酸序列以外的序列等可以根據(jù)引入本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主類型、使用意圖等而適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。有可能通過將本發(fā)明的表達(dá)載體給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者以在活體中產(chǎn)生WTl肽并誘導(dǎo)WTl特異性CTL,隨后通過破壞受試者中的造血腫瘤細(xì)胞或?qū)嶓w癌細(xì)胞，從而治療或預(yù)防造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含WT1多核苷酸或WT1表達(dá)載體。這個(gè)方面中的本發(fā)明的藥物組合物的組成、施用方法等均已在上文描述。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的包含WTl肽或WTl表達(dá)載體的藥物組合物給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者。待治療或預(yù)防的癌癥的實(shí)例包括諸如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤或惡性淋巴瘤的造血腫瘤以及諸如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌或卵巢癌的實(shí)體癌。另一方面，本發(fā)明涉及WT1多核苷酸或WT1表達(dá)載體在制造包含WT1多核苷酸或WT1表達(dá)載體的藥物組合物中的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及含有表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以通過以下方式制備例如通過用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化諸如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞的宿主細(xì)胞。用于將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法可以適當(dāng)?shù)剡x自各種方法。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞、回收并純化產(chǎn)生的WT1肽，本發(fā)明的肽得以制備。再一方面，本發(fā)明涉及WT1特異性CTL，其通過HLA-A*3303限制性WT1肽誘導(dǎo)。本發(fā)明的CTL識(shí)別WT1肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體。因此本發(fā)明的CTL可以應(yīng)用于特異性地破壞HLA-A+3303陽(yáng)性并高水平表達(dá)WT1的腫瘤細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將WT1特異性CTL給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者。給予WT1特異性CTL的方法可以才艮據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)剡x擇例如疾病的類型、受試者的狀態(tài)或耙位點(diǎn)。此方法的實(shí)例包括但不限于靜脈給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥和口腔給藥。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WT1特異性CTL的方法，所述方法包括在HLA-A*3303限制性WT1肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WT1特異性CTL。外周血單核細(xì)胞所得自的受試者可以是任何一個(gè)，只要是HLA-^3303陽(yáng)性受試者。通過在HLA-A*3303限制性WT1肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，WTl特異性CTL從包括于外周血單核細(xì)胞內(nèi)的CTL前體細(xì)胞誘導(dǎo)得到。有可能通過將本發(fā)明的WTl特異性CTL給予受試者以治療或預(yù)防在HLA-A、303陽(yáng)性受試者中的造血腫瘤或?qū)嶓w癌。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)WT1特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的HLA-A*3303限制性WTl肽。優(yōu)選試劑盒在誘導(dǎo)WTl特異性CTL的方法中使用。本發(fā)明的試劑盒可以除包含HLA-A、303限制性WTl肽以外，還包含例如獲得外周血單核細(xì)胞的工具、佐劑和反應(yīng)容器等等。一般來說，說明手冊(cè)附于試劑盒中。通過使用本發(fā)明的試劑盒，可高效地誘導(dǎo)WTl特異性CTL。又一方面，本發(fā)明涉及通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞)，所述抗原呈遞細(xì)胞通過HLA-A、303限制性WTl肽誘導(dǎo)。通過使用本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞，可高效地誘導(dǎo)WTl特異性CTL。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者。給予抗原呈遞細(xì)胞的方法可以才艮據(jù)以下條件適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇例如疾病"類型、受試者的狀態(tài)或靶位點(diǎn)。所述方法的實(shí)例包括但不限于靜脈給藥、皮內(nèi)給藥、皮下給藥、肌內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥和口腔給藥。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)通過HLA-A、303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在HLA-A*3303限制性WTl肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞，使未成熟的抗原呈遞細(xì)刀包誘導(dǎo)成為通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞。未成熟的抗原呈遞細(xì)胞是指可以成熟變?yōu)榭乖蔬f細(xì)胞的細(xì)胞，例如未成熟的樹突細(xì)胞。未成熟的抗原呈遞細(xì)胞所得自受試者可以是任何一個(gè)，只要是HLA-V3303陽(yáng)性受試者。因?yàn)槲闯墒斓目乖蔬f細(xì)胞包括于例如外周血單核細(xì)胞中，所以所述的未成熟的抗原呈遞細(xì)胞可以在WT1肽的存在下培養(yǎng)。另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)通過HLA-A、303分子呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的HLA-A*3303限制性WTl肽。優(yōu)選該試劑盒應(yīng)用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明的試劑盒中所包含的其他組分等已在上文描述過。本發(fā)明的試劑盒可以用于高效地誘導(dǎo)通過HLA-A、30分子呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及抗HLA-A*3303限制性WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苦酸的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。又一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥方法，所述方法包括使用WTl特異性CTL;使用通過HLA-A*3303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞或者使用抗HLA-A*3303限制性WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苷酸的抗體。優(yōu)選WTl特異性CTL應(yīng)用于本發(fā)明用于診斷的方法。例如有可能通過以下方式i貪斷癌癥將CTL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體與來自HLA-A*3303陽(yáng)性受試者的樣品一起溫育；或者將其給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者，然后測(cè)定例如其位置、位點(diǎn)或含量。CTL、抗原呈遞細(xì)胞或抗體可以被標(biāo)記。通過標(biāo)記的附著，可以高效地實(shí)施本發(fā)明用于診斷的方法。另一方面，本發(fā)明涉及用于診斷癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的WTl特異性CTL、通過HLA-A、303分子呈遞WTl肽的抗原呈遞細(xì)胞或抗HLA-A*3303限制性WTl肽的抗體或抗編碼此肽的多核苦酸的抗體。以下實(shí)施例更詳細(xì)地說明了本發(fā)明，但不能將其解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例實(shí)施例1選擇WT1肽用NetMHC2.0程序(TechnicalUniversityofDenmark(丹麥技術(shù)大學(xué)))從來自WT1蛋白(SEQIDNo:l)的WT1肽中選擇出WT1337、WT1364、WTl367和WT14Q9，這些肽是由9個(gè)氨基酸組成的具有適合HLA-A*3303的錨定基序的親水肽(N-末端起的第二個(gè)氨基酸是Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp中的任意一個(gè)并且C-末端的氨基酸是Arg),并預(yù)期其具有與HLA-V3303分子高度的結(jié)合親和力。這些肽的氨基酸序列以及與HLA-A*3303分子結(jié)合親和力示于表1中。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>制備B-LCL細(xì)胞通過Ficoll-Hypaque梯度密度離心方法從取自HLA-A*3303陽(yáng)性的健康捐贈(zèng)者(HLA-A、303/0207)的外周血中分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。然后將PBMCs在含有10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中以約1x107的密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入B95-8細(xì)胞(產(chǎn)生EB病毒的細(xì)胞)的培養(yǎng)上清液。使它們?cè)?7。C、5%C02的條件下培養(yǎng)約1個(gè)月。由此獲得經(jīng)EB病毒轉(zhuǎn)化過的B-LCL細(xì)胞，其為B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞?？梢源_定得到的B-LCL細(xì)胞不表達(dá)WT1基因。用20pg/ml的WT1337、WT1364、WT1367或WT14。9溫育B-LCL細(xì)胞2小時(shí)以對(duì)其進(jìn)行脈沖并用80Gy的輻射對(duì)其進(jìn)行放射。得到的B-LCL細(xì)胞(下文稱為用WT1肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞)作為抗原呈遞細(xì)胞用于以下的實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)CTL特異性WT1(InductionofCTLspecificWT1)3x106的PBMCs(HLA-A、303/1101)于含20|ig/ml的WT1337、WT1364、WTl367或WTUo9的完全培養(yǎng)基(45Q/。RPMI,45%AMI-V培養(yǎng)基和10%人類AB血清)中的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以37。C、5%C02的條件培養(yǎng)1周以獲得應(yīng)答細(xì)胞。獲得的2x106的應(yīng)答細(xì)胞與1x106的用同樣的WT1肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中共培養(yǎng)1周(首4侖刺激)。PBMCs與用WT1肽月永沖過的B-LCL細(xì)胞再共培養(yǎng)三次(第二至第四輪刺激)；培養(yǎng)條件為按照以下方式加入20IU/ml(終濃度)的IL-2:第二輪刺激刺激開始3天后隔天加入共2次；第三和第四輪刺激刺激開始后的第2天隔天加入共3次。獲得的細(xì)胞使用NegativeSelectionColumnsGravityFeedKit(陰斗生選擇才主重力進(jìn)泮+^式劑盒)(StemSp)濃縮致使CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比率達(dá)到大約80%,然后與用WT1肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞共培養(yǎng)(第五輪刺激)。最后一次刺激5天后收獲的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞(CTL)用于4企測(cè)細(xì)胞毒活性。CTL的細(xì)胞毒活性使用"Cr釋放法檢測(cè)CTL的細(xì)胞毒活性。CTL細(xì)胞(在下文稱為效應(yīng)細(xì)胞)以1:1、5:1或10:1的比例(E/T比)與4參入51Cr的耙細(xì)月包在200|il的培養(yǎng)基中混合，并在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以37°C、5%C02的條件培養(yǎng)4小時(shí)。用WT1肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞(BLCL-P)與未用WT1肽脈沖過的B-LCL細(xì)胞(BLCL-NPs)作為靶細(xì)胞使用，所述的WT1肽與曾用于誘導(dǎo)CTL的一樣;。培養(yǎng)后，離心收集上清液。用液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)釋放到上清液的51Cr的量。使用以下公式計(jì)算細(xì)月包毒活性(％):(樣品上清液中的51Cr釋放-自發(fā)的51Cr釋放)/(最大量的51Cr釋放-自發(fā)的5'Cr釋放)x100其中自發(fā)的"Cr釋放是指當(dāng)摻入了"Cr的靶細(xì)胞在同樣的條件下單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)所觀測(cè)到的51Cr的釋放；最大量的51Cr釋放是當(dāng)使用1%TritonX-100完全地裂解纟參入51Cr的靶細(xì)胞時(shí)所觀測(cè)到的51Cr的釋放。結(jié)果在圖l-4出示。圖中，縱坐標(biāo)代表特異性的裂解(。/。)而橫坐標(biāo)代表E/T比。實(shí)線^C表BLCL-P;點(diǎn)線^^表BLCL國(guó)NP。由此i正實(shí)，與BLCL-NP相比，呈遞WT1肽(與HLA-A+3303分子一起形成復(fù)合體)的BLCL-P被用WT1337、WT1364、\\01367或WT1柳誘導(dǎo)的CTL特異性地破壞。用WT1364、百丁1367或WTU。9誘導(dǎo)的CTL用于以下進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。抗內(nèi)源表達(dá)WT1基因細(xì)胞的CTL細(xì)胞毒活性使用以上所描述方法測(cè)定抗TF-1細(xì)胞(表達(dá)WT1基因(HLA-A*3303陽(yáng)性)的腫瘤細(xì)胞)的用WT1364、\￥丁1367或WTl柳誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒活性。使用表達(dá)WT1基因的HLA-A*3303陰性的KS62細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果在圖5-7中出示。圖中，縱坐標(biāo)代表特異性裂解(％)而橫坐標(biāo)代表E/T比。實(shí)線代表TF-1;點(diǎn)線代表K562。由此證實(shí)用WT1364、WT1，或WTl柳誘導(dǎo)的CTL同樣具有抗外源表達(dá)WT1基因細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。使用以上所描述方法測(cè)定抗表達(dá)WT1的B-LCL細(xì)胞的用WT1367誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒活性。表達(dá)WT1的B-LCL(B-LCL-WT1)是指導(dǎo)入了人類WTl基因的、在細(xì)胞中表達(dá)WTl蛋白的并且呈遞由HLA-V3303分子上的加工而產(chǎn)生的由約9個(gè)氨基組成的肽的B-LCL細(xì)胞。使用導(dǎo)入非WTl基因的對(duì)照基因的B-LCL細(xì)胞(B-LCL-CV)作為對(duì)照。結(jié)果在圖8中出示。圖中，縱坐標(biāo)代表特異性裂解(％)而橫坐標(biāo)代表E/T比。實(shí)線代表B-LCL-WT1而點(diǎn)線代表B-LCL-CV。由此證實(shí)用\\^1367誘導(dǎo)的CTL僅破壞HLA-A、303陽(yáng)性并表達(dá)WTl的細(xì)胞。產(chǎn)業(yè)適用性本發(fā)明提供了HLA-A*3303限制性WTl肽、編碼此肽的多核苦酸以及包含此肽和多核苦酸的藥物組合物等等。因此本發(fā)明可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，例如應(yīng)用于為預(yù)防或治療高水平表達(dá)WTl基因的造血腫瘤和實(shí)體癌而開發(fā)并制備各種藥物組合物的領(lǐng)域。權(quán)利要求1.包含由來自WT1蛋白的9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，在氨基酸序列中第9位的氨基酸是Arg。2.權(quán)利要求1的肽，其中所述氨基酸序列選自LeuSerHisLeuGinMetHisSerArg(SEQIDNo:2)、PheSerArgSerAspGinLeuLysArg(SEQIDNo:3)、SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4)和ThrSerGluLysProPheSerCysArg(SEQIDNo:5)。3.權(quán)利要求2的肽，其中所述氨基Sl^列是SerAspGinLeuLysArgHisGinArg(SEQIDNo:4)。4.用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1的肽。5.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的權(quán)利要求4的藥物組合物給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者。6.權(quán)利要求1的肽在制備權(quán)利要求4的藥物組合物中的應(yīng)用。7.編碼權(quán)利要求1的肽的多核普酸。8.包含權(quán)利要求7的多核苷酸的表達(dá)載體。9.用于治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含^又利要求7的多核苷酸或權(quán)利要求8的載體。10.用于治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括將有效量的4又利要求9的藥物組合物給予HLA-A*3303陽(yáng)性受試者。11.權(quán)利要求7的多核苷酸或權(quán)利要求8的載體在制備權(quán)利要求9的藥物組合物中的應(yīng)用。12.WT1特異性CTL，其可通過權(quán)利要求1的肽誘導(dǎo)。13.誘導(dǎo)WT1特異性CTL的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1的肽存在下培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，以從外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)WT1特異性CTL。14.用于誘導(dǎo)WT1特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的權(quán)利要求1的肽。15.呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞，其可通過權(quán)利要求1的肷誘導(dǎo)。16.用于誘導(dǎo)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞的方法，所述方法包括在權(quán)利要求1的肽存在下培養(yǎng)未成熟的抗原呈遞細(xì)胞，以從未成熟的抗原呈遞細(xì)胞誘導(dǎo)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞。17.用于誘導(dǎo)呈遞WT1肽的抗原呈遞細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含作為必需組分的權(quán)利要求1的肽。18.用于診斷癌癥的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求12的CTL或^l利要求15的抗原呈遞細(xì)胞。19.用于測(cè)定HLA-A*3303陽(yáng)性受試者中WT1特異性CTL存在或量的方法，所述方法包括(a)使WT1肽和HLA-A*3303分子的復(fù)合體與來自受試者的樣品反應(yīng)；(b)測(cè)定識(shí)別樣品中含有的復(fù)合體的CTL的存在或量。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述復(fù)合體是四聚體的形式。全文摘要本發(fā)明公開了包含由來自WT1蛋白的連續(xù)九個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽，其中在氨基酸序列中第2位的氨基酸殘基選自Ala、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、Ser和Asp，并且在氨基酸序列中第9位的氨基酸殘基是Arg；編碼此肽的多核苷酸；包含此肽的藥物組合物；以及其它。文檔編號(hào)A61K48/00GK101384716SQ200780005970公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2007年2月21日優(yōu)先權(quán)日2006年2月22日發(fā)明者杉山治夫申請(qǐng)人:株式會(huì)社癌免疫研究所