涂布，于37°C生化培養(yǎng)箱中倒 置培養(yǎng)48小時(shí)(每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行)記錄平板上的菌落個(gè)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明該菌具有 很強(qiáng)的耐酸能力。
[0030] 表3耐酸能力檢測(cè)[(土s) X 107cfu/ml]
[0031]
[0032] 菌CGMCC NO.11763的黏附能力測(cè)定
[0033] 培養(yǎng)CGMCC NO. 11763(MRS液體培養(yǎng)基）、大腸桿菌DH5a(LB液體培養(yǎng)基)24h得發(fā)酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離心10min，收集菌泥，分別用pH = 7.0的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離心 lOmin，收集菌體）。自凝集率（％ :用無(wú)菌的roS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長(zhǎng)600nm處 的吸光值為〇. 4±0.1 (A0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，自凝集率（％ ) 公式為(A0-A24)/A0。；他凝集率（％ :將CGMCC N0.11763和大腸桿菌DH5a的懸菌液調(diào)節(jié)成 在波長(zhǎng)600nm處的吸光值為0.6 ± 0.1 (A0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測(cè)定吸光值A(chǔ)24，他凝 集率（％)公式為（40-424)/^0。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，可知061(^^).11763的自凝集率為 95.71%，有很強(qiáng)的黏附能力。
[0034]表4黏附能力表
[0035]
[0036] 菌株生理特性
[0037] 所述植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)XH于2015年11月30日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC N0.11763,保藏地 址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。 [0038]該菌株特點(diǎn)如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)鞭毛， 不產(chǎn)芽孢;在固體培養(yǎng)基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態(tài)為圓形，邊緣較整齊。
[0039] 理化特征為:過(guò)氧化氫酶(-)，明膠液化(-)，吲哚實(shí)驗(yàn)( + )，運(yùn)動(dòng)性(-)，發(fā)酵產(chǎn)氣 (_)，亞硝酸鹽還原(_)，發(fā)酵產(chǎn)氣(_)，產(chǎn)硫化氫氣體(_)，pH4.0 MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(+ )。經(jīng)過(guò) 生理生化鑒定為為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH〇
[0040] 菌株能夠在57°C下生長(zhǎng)良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0041] 本發(fā)明植物乳桿菌由采集人李建樹(shù)，從新疆維吾爾族老鄉(xiāng)家中酸奶中分離得到， 采集時(shí)間2015年6月2日。
[0042] 5L發(fā)酵罐試驗(yàn)
[0043] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCCN0.11763-環(huán)，接入裝有50mL培養(yǎng)基MRS(無(wú)瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培養(yǎng)12h左右，使菌體處 于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
[0044] (2)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L MRS液體培養(yǎng)基(初始葡萄糖為150g/L)的5L發(fā)酵 罐中。接種量為10%，37°c下lOOrpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù)前期溶氧控制10% (通氣0.5L/min)，后 期厭氧培養(yǎng)63小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，植物乳桿菌CGMCC N0.11763的乳酸產(chǎn)量達(dá)到110g/L。這樣 的產(chǎn)乳酸速率利于泡菜的快速發(fā)酵。
[0045] (4)將對(duì)數(shù)期的菌種接入裝有3L亞硝酸鈉液體篩選培養(yǎng)基(單一氮源為2g/L亞硝 酸鈉的改性MRS篩選培養(yǎng)基）的5L發(fā)酵罐中。接種量為10%，37°C下lOOrpm培養(yǎng)8小時(shí)，對(duì)數(shù) 前期溶氧控制10% (通氣〇.5L/min)，后期厭氧，發(fā)酵過(guò)程根據(jù)亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鈉溶液，培養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，計(jì)算發(fā)酵過(guò)程植物乳桿菌CGMCC N0.11763 對(duì)亞硝酸鈉的降解速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在該條件下，XH對(duì)亞硝酸鈉的降解速率可以達(dá)到653mg/ h/L〇
[0046] (5)將對(duì)數(shù)期的菌種10mL接入裝有2kg預(yù)處理過(guò)的白菜中，按照傳統(tǒng)泡菜方法進(jìn)行 加工，每12小時(shí)測(cè)定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，XH菌對(duì)亞硝酸 鈉的分解速率為10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鈉含量始終低于4.8mg/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)GB2714-2003中規(guī)定的含量(20mg/kg)。
[0047] 活菌計(jì)數(shù)
[0048] 取各保護(hù)劑冷凍干燥所得菌粉1份(冷凍干燥前為lmL，冷凍干燥后重量為0.15g)， 分別加入10mL10%的脫脂乳溶液中，復(fù)水30min。取lmL復(fù)水后的乳酸菌液，用8g/L的生理鹽 水稀釋10個(gè)梯度，取各梯度菌液O.lmL涂平板，每個(gè)梯度2個(gè)平行實(shí)驗(yàn) [17]，于37°0下培養(yǎng) 48h，記錄菌落數(shù)在30-300個(gè)之間的數(shù)據(jù)，并求平均值，計(jì)算菌粉中乳酸菌存活的總菌數(shù)記 為V2〇
[0049] 公式：
[0050] 總菌數(shù)/ml (g)=(同一稀釋梯度2個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)取樣體積 [0051 ]存活率的計(jì)算
[0052]存活率1〇〇
[0053] Vi一一干燥前的活菌數(shù)(lmL液體樣的活菌數(shù)，cf u/mL)
[0054] V2--干燥后的活菌數(shù)（lmL液體樣的活菌數(shù)，cfu/mL)
[0055] 根據(jù)各菌粉存活率的差異可以得到對(duì)乳酸菌制作菌粉保護(hù)效果最佳的保護(hù)劑。
[0056] 制得的菌粉菌存活率達(dá)到95%。
[0057] 實(shí)施例1
[0058]植物乳桿菌固定化制劑由如下方法制得植物乳桿菌液體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期時(shí) 停止發(fā)酵離心收集菌體備用。冷凍干燥保護(hù)劑以10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)，添加3%小分子聚 谷氨酸(20萬(wàn)Da)、1 %大分子普魯蘭多糖、8%麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑溶液稀釋菌體，將 懸浮液中菌體濃度調(diào)節(jié)為101()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預(yù)凍4小時(shí)后，置于真 空度為1. 〇pa的冷凍干燥器凍干24小時(shí)制得菌粉。
[0059] 實(shí)施例2
[0060] 植物乳桿菌固定化制劑由如下方法制得植物乳桿菌液體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期時(shí) 停止發(fā)酵離心收集菌體備用。冷凍干燥保護(hù)劑以10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)，添加5%小分子聚 谷氨酸(20萬(wàn)Da )、2 %大分子普魯蘭多糖、12 %麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑溶液稀釋菌體，將 懸浮液中菌體濃度調(diào)節(jié)為101()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預(yù)凍4小時(shí)后，置于真 空度為l.Opa的冷凍干燥器凍干24小時(shí)制得菌粉。制得的菌粉存放2個(gè)月后存活率達(dá)到 95%〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物乳桿菌固定化制劑制備方法，植物乳桿菌液體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期時(shí)停止 發(fā)酵離心收集菌體備用;冷凍干燥保護(hù)劑以10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)，添加2-5%小分子聚谷 氨酸(20萬(wàn)Da)、1-2%大分子普魯蘭多糖、5-12%麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑溶液稀釋菌體， 將懸浮液中菌體濃度調(diào)節(jié)為101()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預(yù)凍4小時(shí)后，置于 真空度為1. 〇pa的冷凍干燥器凍干24小時(shí)制得菌粉。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種植物乳桿菌固定化制劑制備方法，所述植物乳桿菌植物乳 桿菌（Lactobacillusplantarum)保藏號(hào)為CGMCCNO. 11763。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種植物乳桿菌固定化制劑制備方法，植物乳桿菌液體培養(yǎng)到 對(duì)數(shù)期中后期時(shí)停止發(fā)酵離心收集菌體備用。冷凍干燥保護(hù)劑以10%脫脂乳為懸浮基質(zhì)， 添加3%小分子聚谷氨酸(20萬(wàn)Da)、1%大分子普魯蘭多糖、8%麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑 溶液稀釋菌體，將懸浮液中菌體濃度調(diào)節(jié)為10 1()cfu/mL左右。懸浮液lmL置于-20°C冰箱預(yù)凍 4小時(shí)后，置于真空度為l.Opa的冷凍干燥器凍干24小時(shí)制得菌粉。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種植物乳桿菌固定化制劑制備方法，植物乳桿菌液體培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期中后期時(shí)停止發(fā)酵離心收集菌體備用；冷凍干燥保護(hù)劑以10％脫脂乳為懸浮基質(zhì)，添加2-5％小分子聚谷氨酸(20萬(wàn)Da)、1-2％大分子普魯蘭多糖、5-12％麥精，混合冷凍干燥保護(hù)劑溶液稀釋菌體，將懸浮液中菌體濃度調(diào)節(jié)為1010cfu/mL左右。懸浮液1mL置于-20℃冰箱預(yù)凍4小時(shí)后，置于真空度為1.0pa的冷凍干燥器凍干24小時(shí)制得菌粉。CGMCC NO.1176320151130
【IPC分類(lèi)】C12R1/25, C12N1/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105483008
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511035161
【發(fā)明人】李建樹(shù), 李政
【申請(qǐng)人】天津天綠健科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日