熱穩(wěn)定角蛋白酶及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白酶，且進(jìn)一步特指由臺灣嗜熱菌(Meiothermus Taiwanesis) 分離的微生物角蛋白酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 角蛋白，一種纖維結(jié)構(gòu)蛋白的家族，為皮膚、毛發(fā)、毛料、指甲、鱗片、及羽毛的重要 結(jié)構(gòu)組成。角蛋白多肽為不可溶且可抵抗多數(shù)蛋白酶。環(huán)境中不可溶角蛋白，多以羽毛及毛 發(fā)的形式存在，其累積變成一種固態(tài)廢棄物管理的議題。
[0003] 角蛋白酶可有效率地降解角蛋白。因此，角蛋白酶可用于生物廢棄物的處理使用。 在清潔劑及皮革工業(yè)中，其可做為特殊酶用于分別移除蛋白質(zhì)類污漬及毛發(fā)等。該等應(yīng)用 亦可延伸至毛料及絲綢清潔及藥物。近來，角蛋白酶已被廣泛用于增加動物飼料中蛋白質(zhì) 的可消化性。
[0004] 加熱通常于工業(yè)應(yīng)用中用于加快反應(yīng)使用。此外角蛋白酶粉末的制備中，其噴霧 干燥過程亦需要加熱。因此，一種熱穩(wěn)定角蛋白酶將對于該工業(yè)十分有幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一方面，本發(fā)明涉及一種融合基因，包含：（a)編碼一蛋白分泌信號肽的第一DNA 序列，其位于該融合基因的N端；（b)編碼一臺灣嗜熱菌(M. taiwanensis)WR-220角蛋白酶抑 制域（inhibitory domain)的第二DNA序列，其與第一DNA序列以可轉(zhuǎn)譯框架(translation frame)連結(jié)；及（c)編碼一臺灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域（catalytic domain)的第三 DNA序列，其與第二DNA序列以可轉(zhuǎn)譯框架連結(jié)，其中所述融合基因為一種非自然存在的嵌 合型DNA。
[0006 ]該蛋白分泌信號肽可選自由α-淀粉酶（a 1 pha-amy 1 a s e)信號肽、葡萄糖淀粉酶 (glucoamylase)信號肽、血清白蛋白（serum albumin)信號肽、菊糖酶（inulinase)信號肽、 轉(zhuǎn)化酶(invertase)信號肽、殺手病毒(killer virus)信號肽、溶菌酶（lysozyme)信號肽、 交配型因子a_l(mating factor alpha-1)信號肽、及交配型因子a-2(mating factor alpha-2)信號肽所組成的群組。
[0007] 本發(fā)明的一具體實施例中，所述第一DNA序列編碼一種酵母菌的α因子信號肽。
[0008] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種蛋白表達(dá)載體，包含：（a)前述的融合基因；及(b) - 啟動子，與所述融合基因以可轉(zhuǎn)譯框架連結(jié)。所述啟動子可選自由乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Α0Χ)啟動子、甘油酸磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)啟 動子、轉(zhuǎn)譯延伸因子l_a(translational elongation factor l-α)啟動子、Na+_f禹聯(lián)磷酸 鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na+_coupled phosphate symporter)啟動子及甲酸脫氫酶（formaldehyde dehy drogenas e)啟動子所組成的群組。
[0009 ]在另一方面，本發(fā)明涉及一種含有前述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0010]在另一方面，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含前述的宿主細(xì)胞及一人工培養(yǎng) 基，該宿主細(xì)胞分泌臺灣嗜熱菌(M.taiwanenSiS)WR-220角蛋白酶的催化域至該人工培養(yǎng) 基中。
[0011] 本發(fā)明的另一具體實施例中，所述第二DNA序列包含一核苷酸序列，其與序列編 號：11具有至少90%或95%的相同性。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白酶，包含臺灣嗜熱菌(M. taiwanensis) WR-2 20角蛋白酶催化域，該蛋白酶缺少臺灣嗜熱菌(M. ta i wanen s i s) WR-2 20角蛋白酶抑制 域，以及配制為片劑(^313161：)、囊片（03口161：)、小丸化61161：)、膠囊（038口1116)、顆粒 (granule)、丸劑(pill)、粉末(powder)或藥囊(sachet)、或溶液形式，且不含有細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ) 充物。本發(fā)明的一具體實施例中，所述蛋白酶包含一氨基酸序列，其與序列編號：14具有至 少95 %的相同性。
[0013] 在又另一方面，本發(fā)明涉及一種用于降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)的方法，包含:將該蛋白質(zhì) 類物質(zhì)與有效量的前述蛋白酶接觸。在接觸步驟前，該方法可進(jìn)一步包含制備臺灣嗜熱菌 (M. taiwanensis)WR_220角蛋白酶催化域的步驟。
[0014] 此外，本發(fā)明涉及所述融合基因在用于制備前述蛋白酶以降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)的用 途。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及前述融合基因于制備一前述蛋白酶用于降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)的 用途。此外，本發(fā)明涉及前述蛋白酶于制備一組合物用于降解蛋白質(zhì)類物質(zhì)的用途。該用途 可在高于25°C的溫度施行。于使用前，該蛋白酶可以約高于40°C但低于95°C的溫度進(jìn)行預(yù) 處理，或以一 pH值介于3至10的溶液進(jìn)行預(yù)處理，且仍維持其活性。該蛋白類物質(zhì)可選自由 動物飼料、食物、牛奶、酪蛋白、彈性蛋白、皮膚、毛發(fā)、毛料、絲、指甲、鱗片、纖維、皮革、羽毛 所組成的群組。
[0016] 在更另一方面，本發(fā)明涉及一種制備臺灣嗜熱菌(M. taiwanensis)WR_220角蛋白 酶催化域的方法，包含(ai)在一培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞在允許臺灣 嗜熱菌(M. taiwanensis)WR-220角蛋白酶的表達(dá)且分泌該催化域至培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)； 或（aii)培養(yǎng)一轉(zhuǎn)化有表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)質(zhì)粒包含一編碼臺灣嗜熱菌 (M. taiwanensis )WR-220角蛋白酶的抑制域及催化域的DNA插入片段，所述宿主細(xì)胞在允許 臺灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶的表達(dá)且分泌該催化域其進(jìn)入培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng);及(b)移 除該宿主細(xì)胞以獲得含有臺灣嗜熱菌(M.taiwanen SiS)WR-220角蛋白酶催化域的上清液； 及(c)從該上清液中分離出該催化域，或借由噴霧干燥法或其它方法來將脂質(zhì)從上清液中 去除，以得到固體形式的催化域。
[0017] 在又另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的蛋白酶，包含臺灣嗜熱菌(M. taiwanensis) WR-220角蛋白酶催化域且缺乏抑制域，該蛋白酶借由前述方法制備。
[0018] 本發(fā)明的另一具體實施例中，該抑制域包含一氨基酸序列，其與序列編號：13具有 至少95%的相同性；以及該催化域包含一氨基酸序列，其與序列編號：14具有至少95%的相 同性?；蛘撸撘种朴虬蝗缧蛄芯幪枺?3的氨基酸序列，以及該催化域包含一如序列編 號：14的氨基酸序列。
[0019] 這些與其它方面將借由下述較佳具體實施例，并搭配以下圖式得以更明晰，雖然 其中可存在各種變動及修改，但仍不背離本發(fā)明新穎觀念的精神及范疇。
[0020] 所附的圖式用于闡述本發(fā)明的一個或多個具體實施例，且與所揭露的說明書，用 于解釋本發(fā)明的原理。有可能的是，用于圖式中的相同代號，可能指具體實施例中的相同或 相似組件。
【附圖說明】
[0021 ] 圖1A-圖1C顯示臺灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220對于完整雞只的羽毛的降解 能力。圖1A顯示于第0天時，含有作為碳及氮源的羽毛的培養(yǎng)基為澄清的。于第2天，該混濁 的培養(yǎng)基顯示羽毛的降解及微生物的生長。圖1B顯示殘留于培養(yǎng)基中的羽毛。圖1C顯示分 別經(jīng)臺灣嗜熱菌處理或沒有處理的殘留羽毛重量（圖1C左），或殘留于培養(yǎng)基中不可溶殘留 物的重量，及于培養(yǎng)上清液中由降解的羽毛所得可溶游離氨基酸量(圖1C右）。
[0022]圖2A-圖2B顯示由臺灣嗜熱菌WR-220所分泌的胞外蛋白酶于蛋白電泳的片段以及 于酶譜（zymography )檢驗，其角蛋白酶活性位點為染色瓊脂糖復(fù)制培養(yǎng)（agar〇 se r印1 i ca)中澄清的區(qū)域。（圖2A)通過SYPR0RUBY?染色的4-20 %梯度的聚丙烯酰胺膠體電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)〇(圖2B)角 蛋白/酪蛋白粉末中的1%瓊脂糖于。
[0023] 圖3為蛋白電泳的圖片，顯示該重組角蛋白酶的分子量小于30KDa。
[0024] 圖4為一系列圖片，顯示該重組角蛋白酶，對于牛奶、酪蛋白、彈性蛋白、及羽毛的 蛋白質(zhì)具有寬廣范圍的蛋白水解活性。角蛋白酶用量〇yg、lyg、2yg、4yg、8yg及16yg分別以 ￡l、t)、C、d、Θ/JΛ 〇
[0025] 圖5Α-圖5Β的圖片顯示角蛋白酶的熱及pH耐受性。圖5Α為一澄清區(qū)域環(huán)繞在碟形 濾紙周遭，其顯示蛋白酶的活性。相對的加熱溫度標(biāo)示于近濾紙?zhí)?。圖5Β顯示相對的pH值標(biāo) 示于靠近長形濾紙?zhí)帯?br>[0026] 圖6顯示該蛋白酶活性于紙上杯碟瓊脂擴(kuò)散測定法(paper disk-agar diffusion assay)的結(jié)果。將8個選擇的酵母菌克?。ǖ?天）的培養(yǎng)上清液收集以進(jìn)行蛋白酶活性分 析。
[0027] 圖7顯示該8個選擇的酵母菌克隆(No.2、3、5、7、8、9、10及12)的培養(yǎng)上清液的SDS-pAGE電泳圖。Dl、D2、D3及D5，分別代表第l、2、3及5天。
[0028]圖8A顯示該SPR2261基因（序列編號:3)的核苷酸序列。該克隆部分以粗體表示。其 預(yù)測的分泌蛋白的信號肽以斜體表示。
[0029]圖8B顯示SPR2261基因（序列編號：4)的氨基酸序列。該預(yù)測的分泌蛋白的信號肽 以斜體表示，該預(yù)測的抑制域以下劃線表示，以及角蛋白酶的活性形式(催化域)僅以粗體 表不。
[0030]圖9A顯示該角蛋白酶（序列編號：5)的克隆DNA序列。該第一個甲硫胺酸 (methionine)(起始密碼子）以下劃線標(biāo)示，該抑制域以非粗體標(biāo)示，該截短型的角蛋白酶 活性形式(催化域)僅以