單細(xì)胞捕獲芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微流控技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種單細(xì)胞捕獲芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物技術(shù)研究手段的不斷發(fā)展，生物學(xué)的研究層面正從細(xì)胞種群向單細(xì)胞層面深化拓展。每個(gè)細(xì)胞在時(shí)空上都是獨(dú)一無(wú)二的，盡管它們可能來(lái)自同一祖先，但是不同的時(shí)空環(huán)境決定了它們各自特異的遺傳表達(dá)，從而產(chǎn)生了不同的生物性狀，這對(duì)于進(jìn)化、耐藥性、基因表達(dá)等研究具有重要價(jià)值。然而基于細(xì)胞種群的分析方法往往會(huì)掩蓋群體內(nèi)不同細(xì)胞間出現(xiàn)的差異，忽略這些少量但重要的信息。因此迫切需要研發(fā)基于單細(xì)胞的培養(yǎng)及分析方法，用來(lái)研究不同細(xì)胞個(gè)體間的差異性，了解細(xì)胞的遺傳與代謝機(jī)制。
[0003]從大量細(xì)胞中獲得單個(gè)細(xì)胞是進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)與分析的第一步。傳統(tǒng)的單細(xì)胞獲取方法常采用對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行大量稀釋或者顯微操作的方法來(lái)進(jìn)行。整個(gè)操作步驟復(fù)雜繁瑣，單細(xì)胞獲得效率低。微流控技術(shù)是上世紀(jì)九十年代在分析化學(xué)領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的，它以微管道網(wǎng)絡(luò)微結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)微加工技術(shù)將微管道、微泵、微閥、微儲(chǔ)液器、微檢測(cè)元件等功能元器件像集成電路一樣，集成在芯片材料上。微流控技術(shù)在分離捕獲單細(xì)胞方面很高的效率，通過(guò)在芯片上制作微孔、微篩、微電極等結(jié)構(gòu)，能夠在較短時(shí)間捕獲大量單細(xì)胞，在單細(xì)胞捕獲培養(yǎng)研究方面已經(jīng)有多個(gè)成功的應(yīng)用范例。
[0004]美國(guó)專利申請(qǐng)US20120009671A1中描述了一種基于微孔的單細(xì)胞捕獲方案，該芯片上有上千個(gè)160 μ?? (長(zhǎng))X 160 μ?? (寬)X 160 μπι (深)的微孔，各微孔頂部均有液流通道相連，捕獲前，先將細(xì)胞濃度稀釋到合適水平，然后將稀釋的細(xì)胞液注入液流通道，使各微孔充滿液體后停止注入細(xì)胞液，此時(shí)液流通道中的細(xì)胞在重力作用下沉入微孔，通過(guò)調(diào)整細(xì)胞液的稀釋度可以確保約有10%~30%的微孔中含有單個(gè)細(xì)胞。捕獲的單細(xì)胞在微孔中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液更換則通過(guò)以每秒2 _的速度注入培養(yǎng)液來(lái)實(shí)現(xiàn)。此芯片能夠?qū)崿F(xiàn)160~480個(gè)單元的單細(xì)胞培養(yǎng)。
[0005]針對(duì)上述單細(xì)胞捕獲方案，由于單個(gè)細(xì)胞捕獲是基于單細(xì)胞在平面上的均勻分布實(shí)現(xiàn)的，這就需要調(diào)整輸入細(xì)胞的濃度，使單個(gè)微孔的水平區(qū)域僅含有一個(gè)細(xì)胞，盡管如此，多數(shù)微孔或是未捕獲到細(xì)胞，或是捕獲到兩個(gè)及以上的細(xì)胞，能夠捕獲到單個(gè)細(xì)胞的微孔數(shù)量比例仍然比較低(10~30%)。而且，微孔中細(xì)胞捕獲數(shù)量的不確定性使得必須要通過(guò)顯微成像對(duì)所有微孔區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判別，從中挑出少數(shù)具有單個(gè)細(xì)胞的微孔，整個(gè)判別過(guò)程耗時(shí)且工作量比較大。另外，由于僅靠重力將單細(xì)胞捕獲在微孔中，捕獲力較弱，細(xì)胞容易隨高流速的液流而流失，因此在培養(yǎng)液換液時(shí)，液流流速需要控制在每秒2mm以下，這增加實(shí)驗(yàn)過(guò)程的復(fù)雜性，提高操作難度大。從總體看，由于細(xì)胞捕獲依賴于微孔中的流場(chǎng)分布，這對(duì)于微孔的形制有較大要求；由于微孔不僅作為捕獲結(jié)構(gòu)，還需要作為培養(yǎng)結(jié)構(gòu)，因此特定的微孔形制也決定了有限的細(xì)胞培養(yǎng)空間結(jié)構(gòu)。
[0006]已公開的技術(shù)文獻(xiàn)(Lab Chip, 2012，12，765)公開了一種基于微篩的單細(xì)胞捕獲芯片，該芯片具有多個(gè)串聯(lián)圓形腔室，每個(gè)腔室中央有一對(duì)由兩個(gè)微柱組成的微篩結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞注入腔室時(shí)，單個(gè)細(xì)胞會(huì)被阻滯于微篩處，從而被捕獲，進(jìn)而微篩外圍的上方的圓形微閥通過(guò)加壓，閥膜向下方的液流通道彎曲形變，將微篩區(qū)域與外界液流通道隔離，形成一獨(dú)立腔室，捕獲的單細(xì)胞即在其中培養(yǎng)生長(zhǎng)。換液操作時(shí)，微閥開放數(shù)百毫秒后再次快速關(guān)閉，微閥隔離區(qū)域外的新液在此數(shù)百毫秒短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)入微閥隔離區(qū)域內(nèi)。
[0007]由于單細(xì)胞捕獲力為微篩對(duì)流動(dòng)中細(xì)胞的反作用力，捕獲力強(qiáng)弱與液體流速密切相關(guān)，較強(qiáng)的細(xì)胞捕獲依賴于較高的液體流速。在改變注入液體種類時(shí)，管道中的液流速度容易產(chǎn)生波動(dòng)或或發(fā)生瞬時(shí)流向改變，此時(shí)細(xì)胞極易從微篩上脫離造成捕獲失敗，因此該方案對(duì)液體流速控制要求較高。換液操作時(shí)，外部新液依靠微閥瞬時(shí)開放(數(shù)百毫秒)而擴(kuò)散進(jìn)入中央?yún)^(qū)域，這對(duì)微閥開放時(shí)間的控制要求極高。而且依靠濃度差擴(kuò)散進(jìn)入的新液量十分有限，內(nèi)外液體更換是不完全的，當(dāng)中央隔離培養(yǎng)區(qū)域直徑增大時(shí)，依靠擴(kuò)散進(jìn)行換液的效果將下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的主要目的在于提出一種單細(xì)胞捕獲芯片，該芯片單細(xì)胞捕獲力較強(qiáng)，被捕獲細(xì)胞不易從捕獲位點(diǎn)脫離，能夠從有限數(shù)量的細(xì)胞中，通過(guò)沖洗操作可以方便的得到單細(xì)胞，并可快速更換單細(xì)胞的環(huán)境溶液。
[0009]為了達(dá)成前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種單細(xì)胞捕獲芯片，包括:
液流層，包含液流通道，所述液流通道分別通過(guò)液流輸入管道、液流輸出管道的接口與芯片外部連通，
彈性膜層，包括設(shè)置在所述液流通道上的彈性膜，
驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)，至少用以驅(qū)使所述彈性膜的局部區(qū)域產(chǎn)生趨向所述液流通道的形變和/或位移，從而在所述彈性膜層與液流層之間形成用于截留流經(jīng)所述液流通道的液流內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞空穴。
[0010]進(jìn)一步的，所述彈性膜分布于所述液流層與驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)之間，使所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)與液流通道相互隔離。
[0011 ] 進(jìn)一步的，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)至少可選自電致動(dòng)機(jī)構(gòu)、磁致動(dòng)機(jī)構(gòu)、光致動(dòng)機(jī)構(gòu)、液壓驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)或氣動(dòng)機(jī)構(gòu)，且不限于此。
[0012]在一實(shí)施方案之中，所述驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)包括設(shè)置在彈性膜層上的氣動(dòng)控制層。
[0013]進(jìn)一步地，所述細(xì)胞空穴的大小與單個(gè)細(xì)胞的直徑等于或者略小于單個(gè)細(xì)胞的直徑。
[0014]進(jìn)一步地，所述彈性膜層包括設(shè)置在液流通道上的彈性膜，所述彈性膜將液流通道與氣動(dòng)控制層隔離。
[0015]進(jìn)一步地，所述氣動(dòng)控制層包括設(shè)置在彈性膜上的氣動(dòng)控制管道，所述氣動(dòng)控制層根據(jù)氣動(dòng)控制管道內(nèi)的流體壓力控制彈性膜的形變和/或位移，從而在所述彈性膜與液流層之間形成所述細(xì)胞空穴。
[0016]其中，至少所述氣動(dòng)控制管道的局部區(qū)域與所述液流通道交叉，特別是，所述氣動(dòng)控制管道至少在所述液流通道內(nèi)的細(xì)胞空穴上方穿越。
[0017]在本發(fā)明中，通過(guò)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)驅(qū)使所述彈性膜的局部區(qū)域產(chǎn)生趨向所述液流通道的形變和/或位移，使彈性膜的局部位點(diǎn)，例如離散分布的多個(gè)位點(diǎn)凸露至液流通道，從而可在所述彈性膜層與液流層之間形成用于截留流經(jīng)所述液流通道的液流內(nèi)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞空穴。
[0018]而作為較佳實(shí)施方案之一，可在所述液流通道內(nèi)固定連接復(fù)數(shù)個(gè)凸起部，當(dāng)所述彈性膜產(chǎn)生趨向所述液流通道的形變和/或位移，特別是相對(duì)微小的形變和/或位移時(shí)，在所述彈性膜與液流通道之間于相鄰設(shè)置的復(fù)數(shù)個(gè)凸起部之間形成所述細(xì)胞空穴。
[0019]作為較佳實(shí)施方案之一，所述彈性膜暴露于所述液流通道內(nèi)的局部表面上固定連接有復(fù)數(shù)個(gè)凸起部，當(dāng)所述彈性膜產(chǎn)生趨向液流通道的形變和/或位移時(shí)，在所述彈性膜與液流通道之間于相鄰設(shè)置的復(fù)數(shù)個(gè)凸起部之間形成所述細(xì)胞空穴。
[0020]較為優(yōu)選的，當(dāng)所述彈性膜產(chǎn)生趨向液流通道的形變和/或位移時(shí)，在所述彈性膜與液流通道之間于相鄰設(shè)置且呈環(huán)形布局的復(fù)數(shù)個(gè)凸起部之間形成所述細(xì)胞空穴。
[0021]在一典型實(shí)施案例中，當(dāng)所述彈性膜產(chǎn)生趨向液流通道的形變和/或位移時(shí)，在所述彈性膜與液流通道之間于相鄰設(shè)置且呈三角環(huán)形布局的三個(gè)凸起部之間形成有所述細(xì)胞空穴。
[0022]作為較佳實(shí)施方案之一，所述液流通道內(nèi)固定連接有M個(gè)第一凸起部，同時(shí)所述彈性膜暴露于所述液流通道內(nèi)的局部表面上固定連接有N個(gè)第二凸起部，當(dāng)所述彈性膜產(chǎn)生趨向液流通道的形變或位移時(shí)，所述彈性膜與液流通道之間在相鄰設(shè)置的復(fù)數(shù)個(gè)第一凸起部之間和/或相鄰設(shè)置的復(fù)數(shù)個(gè)第二凸起部之間和/或相鄰設(shè)置的m個(gè)第一凸起部與η個(gè)第二凸起部之間形成所述細(xì)胞空穴，M、N、m、n均為正整數(shù)，并且M與N不同時(shí)等于l，m與η不同時(shí)等于I。