一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然藥物技術(shù)領(lǐng)域，關(guān)于麥冬須根中化合物的分離純化方法，具體涉及利用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根提取物中分離出甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥麥冬(Oph1pogonis Radix)為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物麥冬Oph1pogon japonicus (L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根，為傳統(tǒng)常用中藥之一；具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心的功效；主治肺燥干咳、陰虛癆咳、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等。本品主產(chǎn)于浙江省和四川省，分別被稱為浙麥冬和川麥冬。研究表明，高異黃酮是麥冬中一類重要的小分子活性成分，其母核骨架碳數(shù)為16個，比通常的異黃酮類化合物的B環(huán)和C環(huán)之間多了一個亞甲基；這類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抑制磷酸化、抗雌激素、抗誘變、鎮(zhèn)咳、抗真菌、誘導(dǎo)血管舒張和肝細(xì)胞保護(hù)等多方面的生物活性和作用。
[0003]甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B (結(jié)構(gòu)式見圖1)是麥冬中主要的高異黃酮類成分，但由于結(jié)構(gòu)相似，在水、甲醇、乙腈等溶液中溶解度低。目前國內(nèi)外所采用的硅膠柱層析、凝膠層析以及制備液相色譜等方法分離效果均不理想，通常無法在較短時間內(nèi)使其得到有效分離，需進(jìn)行多次純化及重復(fù)制備，操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力。而且采用麥冬塊根藥材進(jìn)行制備，成本高，還會大量消耗麥冬藥材資源。麥冬須根是麥冬傳統(tǒng)藥用部位塊根加工過程中的廢棄物，通常作為動物飼料或直接丟棄。
[0004]高速逆流色譜(HSCCC)—種基于液-液分配機(jī)理的新型色譜分離純化技術(shù)。它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，而是利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡。當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，從而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，特別適合于天然生物活性成分的分離。但是實驗發(fā)現(xiàn)單次常規(guī)的HSCCC分離甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物效果也不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法的技術(shù)方案，該方法具有高效、快速、可在不改變硬件的條件下顯著改善分離效果的優(yōu)勢。
[0006]發(fā)明人對麥冬化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，麥冬須根中甲基麥冬黃燒酮A和甲基麥冬黃燒酮B成分含量顯著高于塊根中含量，因而可以選擇麥冬須根為原料進(jìn)行分離純化。
[0007]發(fā)明人試圖利用一次HSCCC對麥冬須根中甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B進(jìn)行分離，但由于目標(biāo)化合物性質(zhì)極為接近，分離效果不理想。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)循環(huán)HSCCC可以顯著提高分離效果；不同的流動相均可應(yīng)用，只是分離效果和循環(huán)的次數(shù)有所不同。循環(huán)高速逆流色譜硬件條件與常規(guī)高速逆流色譜一致，只是在進(jìn)樣一定時間后將螺旋管出口與流動相栗的入口連接。因此在主機(jī)中經(jīng)過一次分離后未完全分離的兩個組分能夠進(jìn)入高速逆流色譜儀進(jìn)行再分離，如此反復(fù)。當(dāng)檢測器上的兩峰完全分離開之后，切斷螺旋管出口和栗入口的連接，并在前者處收集流出物即可得到具有滿意純度的兩種目標(biāo)產(chǎn)物。
[0008]本發(fā)明具體通過以下方法實現(xiàn):
所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
1)以麥冬須根為原料，經(jīng)乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅膠柱層析獲得僅含有甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物；
2)步驟1)得到的甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物應(yīng)用高速逆流儀器進(jìn)行分離純化，高速逆流儀器條件為將甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物溶于上相中，以10?20mL/min的速度向高速逆流色譜儀中栗入下相，待管路完全充滿固定相后以600?lOOOrpm轉(zhuǎn)動主機(jī)，同時以1?3mL/min的速度栗入流動相，運(yùn)行一定時間后將螺旋管出口與流動相栗的入口連接，根據(jù)HSCCC分離情況，循環(huán)3?8次后，切斷出口和入口的連接，從出口處收集流出物；
3)步驟2)得到的流出液用HPLC進(jìn)行檢測，分別將甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B純度大于98%的收集液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得到單體化合物。
[0009]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟1)中麥冬須根為浙麥冬須根和川麥冬須根。
[0010]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟1)中硅膠柱層析條件:以石油醚和乙酸乙酯體積比為100:0、50:1、20:1,10:1,5:1分別洗脫，洗脫液根據(jù)HPLC檢識合并。
[0011]所述的一種采用循環(huán)高速逆流色譜從麥冬須根中分離兩種高異黃酮的方法，其特征在于所述的步驟2)中高速逆流色譜兩相溶劑體系正己烷:乙酸乙酯:乙醇:乙腈:水體積比為2:1?3:1?4:0?1.5:0.5?2，或正己烷:乙酸乙酯:甲醇:乙腈:水體積比為2:1?3:1?4:0?1.5:0.5?2，上相為固定相，下相為流動相。
[0012]本發(fā)明能夠高效、快速地將麥冬須根中的甲基麥冬黃烷酮A和B混合物有效分離，并且本發(fā)明與常規(guī)多次HSCCC制備相比，具有節(jié)省流動相，減少樣品回收負(fù)擔(dān)、節(jié)約時間等優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0013]圖1為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B結(jié)構(gòu)式；
圖2為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的混合物樣品的HPLC譜圖；
圖3為甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B的循環(huán)HSCCC譜圖；
圖4為甲基麥冬黃烷酮A的HPLC色譜圖；
圖5為甲基麥冬黃烷酮B的HPLC色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0015]實施例1
(1)甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物樣品制備取浙麥冬的干燥須根6 kg，粉碎后用30 L 80%的乙醇超聲輔助提取2次，每次lh，過濾并合并濾液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收提取溶劑。所得浸膏用水稀釋后以乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯浸膏(46.97 g)過娃膠柱色譜，以石油醚:乙酸乙酯(100:0、50:1、20:1、10:1、5:1)分別洗脫2000mL洗脫液根據(jù)HPLC檢識合并，HPLC分析條件如下:色譜柱為Thermo C18(250 mmX4.6 mm, 5 μ m)，柱溫為30 °C，流動相采用水-乙腈(35:65);檢測波長為285nm ;流速設(shè)置為lmL/min。最終得到只含有甲基麥冬黃烷酮A和甲基麥冬黃烷酮B混合物1.50g，HPLC檢測色譜圖見圖2所示。
[0016](2)循環(huán)高速逆流色譜分離制備
應(yīng)用TBE-300A型高速逆流儀器(上海同田生物技術(shù)有限公司)將以上制得甲基麥冬黃烷酮A