一種人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的高效擴(kuò)增培養(yǎng)體系的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的高 效擴(kuò)增培養(yǎng)體系。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)皮祖細(xì)胞巧ndothelialprogenitorcells,EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì) 胞，主要存在于廝帶血、成人外周血、骨髓。內(nèi)皮祖細(xì)胞與造血干細(xì)胞來(lái)自共同的中胚層前 體細(xì)胞血液血管母細(xì)胞化emangioblast)，在生理或病理因素刺激下，可W從骨髓動(dòng)員到 外周血中參與損傷血管的修復(fù)，而廝血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞起源于胎兒的肝臟。近年來(lái)的研究 顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞在必腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮 重要作用，同時(shí)，因其可分化為表達(dá)FVIII的血管內(nèi)皮細(xì)胞，可作為一種細(xì)胞治療途徑用于 FVIII缺乏的甲型血友病。
[0003] 正常情況下，內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量極少，外周血中約為500-1000個(gè)/mU廝血中的數(shù) 量約高3. 5倍。早期的內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)Η種祖細(xì)胞分子標(biāo)志；CD133XD34和血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子受體-2 (VEGFR-2)，之后逐漸失去CD133表型和祖細(xì)胞特性，并開始表達(dá)內(nèi)皮系的特征 性分子標(biāo)志；血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-UCD31)，假性血友病因子（vWF)W及凝血VIII因 子（FVIII)，從而分化為晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，繼續(xù)分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。
[0004]目前，內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)是從廝血、外周血、骨髓等標(biāo)本中獲得的單個(gè)核細(xì)胞 或CD34XD133陽(yáng)性選擇后的單個(gè)核細(xì)胞，在體外包被有人纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N) 的基底上加入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendotheliagrowthfacto;r，VEGF)、成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子（fibroblastgrowthfactorJGF)等內(nèi)皮生長(zhǎng)因子進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增和分 化?，F(xiàn)有的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可W在體外對(duì)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增，但 在保持干性和數(shù)量上有局限。
[0005] 目前，內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)可W獲得一定數(shù)量供科研需要，但還無(wú)法實(shí)現(xiàn)較大 規(guī)模生產(chǎn)的需求，并且不能充分保持祖細(xì)胞的干性。因此，本領(lǐng)域亟待提高擴(kuò)增的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)皮祖細(xì)胞（人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞）的高效擴(kuò)增培養(yǎng)體 系。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種培養(yǎng)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法（為非治療性方 法），所述方法包括：
[0008] (1)利用干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基擴(kuò)增CD34+單個(gè)核細(xì)胞（較佳地為CD34\CD133+單個(gè) 核細(xì)胞）；
[0009] (2)將步驟（1)擴(kuò)增后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得人血管內(nèi)皮 祖細(xì)胞；
[0010] 其中，所述的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基包括；干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及如下細(xì)胞因子：
[0011]干細(xì)胞因子（SCF) ;50-500ng/mL;
[0012] Flt3-配體（FLT-3L) ;50-500ng/mL;
[001引血小板因子（ΤΡΟ) ;5-200ng/mL;
[0014]白介素 3 (比-3) ;5-250ng/mL;
[0015] 粒細(xì)胞集落刺激生物因子（GM-CS巧；5-25ng/mL;和
[0016]Sail樣蛋白 4B(Sal14B) :l-10ng/mL。
[0017] 其中，所述的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基包括；內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及如下組分：
[001引血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF) ;10-100ng/mL;
[0019] 膜島素樣生長(zhǎng)因子（IGF) :5-100ng/mL;
[0020] 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子巧GF) ;2-20ng/mL;
[0021] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因化-FGF) ;5-100ng/mL;
[0022]抗壞血酸（AscorbicAcid) ;0. 5-5μg/血；
[0023]肝素Ofeparin);50-200U/mL;
[0024]氨化可的松（Hy化ocortisone) ;80-300ng/mL;和 [00巧]L谷胺醜胺（Χ-glutamine)
[0026] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自（但不限于）；ModifiedIMDM培養(yǎng) 基或Modified StemSpan培養(yǎng)基；或所述的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自（但不限于）；EGM-2培 養(yǎng)基、1199、1200培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基（較佳地含有15-25%胎牛血清）。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，步驟（1)包括；CD34+單個(gè)核細(xì)胞加入到所述的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng) 基中，使得細(xì)胞濃度為5-40X104個(gè)細(xì)胞/mL(較佳地為10-25X104個(gè)細(xì)胞/mL);培養(yǎng)2-4 天后根據(jù)細(xì)胞數(shù)目增加量添加所述的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基使得細(xì)胞濃度為5-40X104個(gè)細(xì)胞 /mL(較佳地為10-25X104個(gè)細(xì)胞/mL);步驟（1)進(jìn)行5-7天。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2)包括；步驟（1)進(jìn)行5-7天后，將獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到所 述的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基中、置于包被有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)基中密 度為0. 3-3X106個(gè)細(xì)胞/mL(較佳地0. 5-2X106個(gè)細(xì)胞/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天后吹散細(xì)胞， 選擇貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)；后續(xù)每3天更換1次內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基；更換3-6次后收獲細(xì)胞。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于擴(kuò)增CD34+單個(gè)核細(xì)胞的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基， 其中包括；干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及如下細(xì)胞因子：
[0030]干細(xì)胞因子（SCF) ;50-500ng/mL;
[0031]Flt3-配體（FLT-3L) ;50-500ng/mL;
[0032]血小板因子（ΤΡΟ) ;5-200ng/mL;
[0033]白介素 3 (比-3) ;5-250ng/mL;
[0034] 粒細(xì)胞集落刺激生物因子（GM-CS巧；5-25ng/mL;和
[0035]Sail樣蛋白 4B(Sall4B) ;l-10ng/血。
[0036] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的用于擴(kuò)增CD34+單個(gè)核細(xì)胞的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，中包括 如下細(xì)胞因子：
[0037]干細(xì)胞因子；100-300ng/mL;
[0038]Flt3-配體；100-300ng/mL;
[0039]血小板因子；10-60ng/mL;
[0040]白介素 3 ;10-150ng/mL;
[0041] 粒細(xì)胞集落刺激生物因子：8-2化g/mL;和
[0042]Sail樣蛋白 4B;2-8ng/mL。
[0043] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中包括： 內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基W及如下組分：
[0044] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；1〇-10化g/mL;
[0045] 膜島素樣生長(zhǎng)因子；5-100ng/mL;
[0046] 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；2-2化g/mL;
[0047] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因；5-100ng/mL;
[004引抗壞血酸；0. 5-5μg/mL;
[0049]肝素；50-200U/mL;
[0050]氨化可的松；100-300ng/mL;和
[0051]L谷胺醜胺；l-5mM。
[0052] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的用于培養(yǎng)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)基中，所述組分包 括：
[0053] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；3〇-80ng/mL;
[0054] 膜島素樣生長(zhǎng)因子；10-60ng/mL;
[0055] 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；5-15ng/血；
[0056] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因；8-8化g/mL;
[0057]抗壞血酸；1-4μg/mL;
[0058]肝素：80-150U/mL;
[0059]氨化可的松；100-200ng/mL;和
[0060]L谷胺醜胺；2-4mM。
[0061] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基的用途，用于制備人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。
[0062] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的試劑盒，所述試劑 盒中包括：
[0063] (a)所述的用于擴(kuò)增CD34+單個(gè)核細(xì)胞的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基；和
[0064] 化）所述的用于培養(yǎng)人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0065] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
【附圖說(shuō)明】
[0066] 圖1、本發(fā)明對(duì)人廝血CD34+干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增情況（I)。
[0067]A、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0068]B、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)；
[0069]C、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)目；
[0070]D、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)；
[0071]E、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0072]F、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。
[0073] 圖2、本發(fā)明對(duì)人廝血干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增及分化結(jié)果的鑒定。
[0074]A、人廝血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增及分化的細(xì)胞形態(tài)圖；
[00巧]B、人廝血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增后免疫英光鑒定圖。
[0076] 圖3、本發(fā)明對(duì)動(dòng)員后人外周血CD34+干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增（I)。
[0077]A、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0078]B、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)；
[0079]C、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)目；
[0080]D、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)；
[0081]E、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0082]F、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。
[0083] 圖4、本發(fā)明對(duì)動(dòng)員后人外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞貼壁擴(kuò)增及分化結(jié)果的鑒定。
[0084]A、動(dòng)員后人外周血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增及分化的細(xì)胞形態(tài)圖
[0085]B、人廝血來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增后免疫英光鑒定圖
[0086] 圖5、本發(fā)明對(duì)人廝血CD34+干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增情況（II)。
[0087]A、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0088]B、總細(xì)胞和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)；
[0089]C、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)目；
[0090]D、表達(dá)CD133和VEGFR-2的早期內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)；
[0091]E、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增數(shù)目；
[0092]F、貼壁培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。
[0093] 圖6、