一種獼猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及植物病原菌分離技術領域，尤其設及一種雜猴桃潰瘍病感病樣本的快 速鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 雜猴桃具有很高的營養(yǎng)及經(jīng)濟價值，是當今世界發(fā)展最為迅速的水果。我國是世 界雜猴桃起源和分布中屯、，擁有豐富的雜猴桃種質(zhì)資源，目前已超越新西蘭及意大利成為 世界雜猴桃栽培面積和產(chǎn)量最大的國家。雜猴桃產(chǎn)業(yè)對農(nóng)民增收和產(chǎn)業(yè)結構調(diào)整具有重要 意義。
[0003] 雜猴桃潰瘍病是一種由下香假單胞桿菌雜猴桃致病變種（Pseudomonassyringae pv.Actinidiae，簡稱Psa)引起的細菌性病害。該病自1983年在日本首次被發(fā)現(xiàn)W來，現(xiàn) 已在新西蘭、意大利、中國、法國、日本、伊朗、葡萄牙、智利和韓國等二十個國家中出現(xiàn)，并 對全球雜猴桃產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。目前，該病在我國的陜西、四川、湖南、貴州、江蘇、 浙江、廣西和安徽等10個省份均已發(fā)生，僅2013年，感病面積已達到1828公頃，累計經(jīng)濟 損失3. 23億元。
[0004]雜猴桃潰瘍病菌主要借助風雨，或在修剪、綁枝等操作時借助操作工具，從植株的 氣孔、水孔、皮孔、傷口（蟲傷、凍傷、刀傷）等處侵入，擴延至整個枝蔓及果園發(fā)病。在我 國，該病一般在2月下旬至3月上旬開始發(fā)病，主干和枝條感病后龜裂，產(chǎn)生乳白色粘質(zhì)菌 脈；在3月中下旬至4月下旬，與植物傷流混合后呈黃褐色或誘紅色，初皮部局部潰瘍腐爛。 葉片上一般在4月份開始出現(xiàn)癥狀，在新生葉片上呈現(xiàn)不規(guī)則形或多角形、褐色斑點，后發(fā) 展成病斑周圍有3-5mm的黃色暈圈，葉片焦枯、卷曲。藤蔓上感病后，部分變成深綠色、水潰 狀，常形成l-3mm長的縱向裂縫。4月下旬到5月中旬，潰瘍病菌開始侵染花蕾，花蕾感病 后不能張開，變褐枯死后脫落。6月份至8月份，溫度升高時，病原菌進入休眠期。9-11月， 部分地區(qū)葉片和枝條上可能再次出現(xiàn)感病癥狀。12月至來年2月，病原菌主要在植株的皮 孔、氣孔及果柄處定植，也可隨病殘體在±壤中定植，侵染速度減弱；來年2月繼續(xù)侵染，由 此形成周年循環(huán)，嚴重時導致樹體死亡（具體感病癥狀見圖1)。
[0005] 雜猴桃潰瘍病的病原菌是下香假單胞桿菌雜猴桃致病變種（簡稱Psa)，是一種細 菌性病害。由于雜猴桃細菌性潰瘍病已被列入全國森林檢疫對象名單，因此在最短的時間 內(nèi)快速檢測外來或本地苗木上是否帶有病原菌是防止該病擴散的有效手段，也是目前的重 點研究方向。
[0006] 雜猴桃潰瘍病的診斷技術經(jīng)歷了從表面癥狀觀察一菌落形態(tài)觀察一顯微鏡檢查 一PCR快速檢測4個階段。PCR技術是20世紀80年代中期建立的一項體外迅速、大量擴 增目的基因的技術，已廣泛地應用于分子生物學、醫(yī)學和農(nóng)學等學科，用于基因的克隆遺傳 分析和疾病診斷等。由于PCR能夠特異擴增某一DNA片段，因此，在病原微生物的檢測上， 比傳統(tǒng)方法有優(yōu)勢，如PCR技術檢測生物體時不需要培養(yǎng)，具有極高的靈敏度和快速等。近 10多年來，PCR技術在植物病害檢測中得到了廣泛應用，也有不少學者對雜猴桃潰瘍病菌 (Psa)分子檢測技術進行了研究，如2010年，Rees-George等基于rDNA的16-23S內(nèi)轉錄間 隔區(qū)（ITS序列）設計了 1對雜猴桃潰瘍病菌的特異性鑒定引物（PsaFl、PsaR2)，并將引物 在與PSA病原菌親緣關系較近的6個屬17個種共計56個菌株進行了特異性擴增，進一步 驗證了 引物的可靠性（Plantpathology, 2010, 59:453-464)。2011 年，Marcelletti等運 用通用引物對Psa及其他P.syringae菌株的7個持家基因gy;rB、巧oB、巧〇0、acnB、fruK、 gltA及pgi序列進行了MLST分析，認為Psa菌株與P.syringaepv.theae親緣關系最近 (PLoS0肥，2011，6 :1-17)。
[0007] 雜猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒定，可W使我們盡快準確地確定樣本中是否含有 病原菌，防止病原菌的大規(guī)模傳播，同時促進了該病原菌WDNA為基礎的檢測方法的發(fā)展。 但目前，尚未有雜猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒定方法的相關專利報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是彌補現(xiàn)有技術的不足，提供一種雜猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒 定方法；本發(fā)明能在3天時間內(nèi)實現(xiàn)雜猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒定。
[0009] 本發(fā)明的目的是運樣實現(xiàn)的：首先，利用組織勻漿技術釋放分離樣本中的細菌，通 過培養(yǎng)使其增殖，并運用高溫裂解的方法獲得樣本的DNA;隨后，基于特異性引物擴增是否 出現(xiàn)條帶，初步確定病原菌中是否含有Psa病原菌；最后，對意思病原菌的持家基因gltA進 行測序，通過與NCBIBlast中進行序列比對確定該病原菌是否為Psa。
[0010] 具體地說，本方法包括下列步驟：
[0011] ①病原菌的分離
[0012] 將疑似患有細菌性潰瘍病的雜猴桃感病樣品表面用無菌水沖洗干凈，然后用打孔 器從感病部位、健康部位和病健交界處分別切取組織，經(jīng)酒精消毒和無菌水沖洗，再用無菌 濾紙吸干表面水分，得到組織切片；將組織切片置于400yL的lOmmol/LM拆〇4溶液中進行 勻漿，即得勻漿液；
[0013] ②病原菌的培養(yǎng)
[0014] 取IOOyL的勻漿液涂布在固體邸（金氏B)培養(yǎng)基上，將平板置于27-28°C培養(yǎng) 2d;
[001引③病原菌的菌落PCR檢測 [001引A、模板DNA的制備
[0017] 吸取40yL無菌水置于布滿菌落的平板上，用無菌接種環(huán)刮擦菌苔，盡可能使平 板上的菌落懸浮在無菌水中，形成菌懸液，再將菌懸液置于98°C裂解IOmin之后滿旋，閃 離，吸取2yL上清液用于DNA模板；
[001引B、引物序列
[0019]正向引物為PsaFl:5' -TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3'（SEQNO. 1);
[0020] 反向引物為PsaR2 :5, -CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3'（沈QNO. 2);
[0021] 預期擴增產(chǎn)物長度為28化P;
[002引 C、菌落PCR擴增體系
[0023]反應體系為IOyL其中IOXPCRbuffer1yLlOmmol/LdNTP0. 2yL100y mol/L正向引物PsaFl0.IyL，100ymol/L反向引物PsaR20.IyL，5U/yLTaq酶 0.IyL， DMSO0. 2JiL，菌落模板2JiL，無菌去離子水6. 3JiL;
[0024]D、PCR擴增反應程序
[00巧]95°C預變性5min，94°C變性15S，58°C退火30S，72°C延伸30S，30個循環(huán)，72°C延伸 5min，-20°C保存；
[0026] E、取PCR擴增產(chǎn)物5化，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，在280bp處出現(xiàn)單 一擴增條帶的樣本初步鑒定含有雜猴桃潰瘍病的病原菌；
[0027] ④病原菌的分子鑒定
[002引 a、模板DNA的制備
[0029] 對于有特異性條帶的樣本，吸取步驟③中的2yL上清液用于DNA模板；
[0030] b、引物序列
[0031] 正向擴增引物為gltAFP:5' -GCCTCBTGCGAGTCGAAGATCACC-3'（沈QNO. 3);
[0032] 反向擴增引物為gltARP:5, -CTTGTAVGGRCYGGAGAGCATTTC-3'（沈QNO. 4);
[0033] 正向測序引物為gltAFS:5, -CCTGRTCGCCAAGATGCCGAC-3,（沈QNO. 5);
[0034] 反向測序引物為gltARS:5' -CGAAGATCACGGTGAACATGCTGG-3'（SEQNO. 6);
[0035] 預期擴增產(chǎn)物長度為1000 bp;
[003引 C、菌落PCR擴增體系
[0037] 反應體系為 40yL其中IOXPCRbuffer4yL10mmol/LdNTP0.SyLlOOy mol/L正向擴增引物gltAFP0. 2yL100ymol/L反向擴增引物gltARPO. 2yL5U/yL Taq酶0. 25yL，DMSO0. 8yL，菌落模板2yL，無菌去離子水31. 75yL;
[0038] d、PCR擴增反應程序
[0039] 95°(：預變性5111111;94°(：變性155,62°(：退火305,72°(：延伸305,30個循環(huán)；72°(：延 伸 5min，-20°C保存；
[0040] e、取PCR擴增產(chǎn)物40化，送樣測序，正向測序引物為gltAFS,反向測序引物為 gltARS。測序結果與NCBIBLAST進行序列比對，如比對結果與Psa菌株相似度達到99%W 上，確定該樣本中含有雜猴桃潰瘍病的病原菌。
[0041] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：
[0042] ①通過組織勻漿、細菌培養(yǎng)、高溫裂解獲得DNA、PCR擴增及分子測序等方法，實現(xiàn) 了雜猴桃潰瘍病感病樣本的快速鑒定，促進了該病原菌WDNA為基礎的快速檢測方法的發(fā) 展；
[0043] ②具有操作簡單、靈敏性高和特異性強等特點，且檢測結果準確、客觀，對提高雜 猴桃潰瘍病感病樣本的檢測效率及靈敏度具有重要意義；
[0044] ③適用于準確檢測雜猴桃種苗、親本資源和育種中間材料在生長早期是否含有雜 猴桃潰瘍病菌，將有效推動雜猴桃的科研、育種及生產(chǎn)，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0045] 圖1為雜猴桃潰瘍病的感病樣本圖片，
[004引其中：
[0047] A、B、C:主干產(chǎn)生細菌性分泌物；
[0048] D:木質(zhì)部皮孔紅化；
[0049]E:葉片上產(chǎn)生褐色病斑，周圍伴有黃色暈圈；
[0050]F、G:花蕾、幼芽及嫩枝枯萎。
[005。圖2為實施例1中陜西周至疑似感病樣本經(jīng)SEQNO.USEQNO. 2引物菌落PCR檢 測圖片。
[0052]圖3為實施例2中安徽金寨疑似感病樣本經(jīng)SEQNO. 1、SEQNO. 2引物菌落PCR檢 測圖片。
【具體實施方式】
[0053] 下面結合附圖和實施例詳細說明：
[0054] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段均為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手 段。
[00巧]一、方法
[0056] ①病原菌的分離
[0057] A、
[0058] 所述的疑似感病樣品為待檢雜猴桃的葉片、枝條、嫩梢、主干或根部；
[0059] 所述的切取組織其大小為0. 5cm2;
[0060] 所述的酒精其體積濃度為75%，其消毒的時間為IOs;
[0061] 所述的無菌水沖洗其次數(shù)為3次。
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