專利名稱：用于防治獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的內(nèi)生鏈霉菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治獼猴桃細(xì)菌性潰瘍 病的內(nèi)生鏈霉菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(/^et^omonw ^h"gaepv.flc""W/ae)侵染引起的獼猴桃上的重要病害，該病一旦發(fā)生流行，不 僅影響獼猴桃的產(chǎn)量和果品質(zhì)量，嚴(yán)重時常常造成毀園，給^猴桃產(chǎn)業(yè)帶來巨 大損失。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病于1980年在美國加利福尼亞州和日本神州景崗縣 首次發(fā)現(xiàn)，而我國湖南的東山峰農(nóng)場在1985年發(fā)現(xiàn)該病，當(dāng)時造成2000余畝 果園瀕臨毀園。獼猴桃在我國陜西和安徽等省有著廣泛的種植，獼猴桃生產(chǎn)也 是陜西省的重要水果產(chǎn)業(yè)之一，但從1991年起相繼在長安、戶縣、周至以及楊 凌等獼猴桃產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了獼猴桃潰瘍病后，近年來該病有擴大流行的趨勢，給陜 西省的獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重危機。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病多發(fā)生在春季傷流期至 開花末期和秋季，可危害植株的主干、枝蔓、嫩梢、葉片、花蕾和花等部位。 獼猴桃潰瘍病菌主要在藤蔓病枝上越冬，或隨病枝、病葉殘體在土壤中越冬， 翌年3月開始發(fā)病，通過風(fēng)雨、昆蟲、農(nóng)具和農(nóng)事操作進行傳播，從傷口和自 然孔口侵入，3-5天后出現(xiàn)癥狀并產(chǎn)生菌膿進行再侵染，4月下旬出現(xiàn)發(fā)病高峰 期。發(fā)病部位多從弱枝干的皮孔、芽基、葉痕、枝條分叉處開始，低溫高濕利 于發(fā)病，農(nóng)事操作和修剪時機械損傷愈多，病害發(fā)生愈重。
目前防治獼猴桃潰瘍病的藥劑主要是農(nóng)用鏈霉素和石硫合劑，施納寧是陜
5西關(guān)中地區(qū)各植保站推廣的一種防治獼猴桃潰瘍病的新農(nóng)藥，但田間防病效果 均不理想，因而尋找開發(fā)新型、高效及安全的生物農(nóng)藥將對獼猴桃產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定 和發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的旨在尋求防治獼猴桃細(xì) 菌性潰瘍病的內(nèi)生鏈霉菌及活性產(chǎn)物的制備方法。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案具體如下
楊凌青色鏈霉菌(S/r取o，ees g/awcw >sp.朋vya"g/f"g) TIASA5菌株(以下 簡稱為TIASA5菌株)，該菌株已于2007年8月16日保藏在中國科學(xué)院微生物 所菌株保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊 編號為CGMCC No. 2132;保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微 生物研究所，郵政編碼100101。
本發(fā)明還有一個目的是提供TIASA5菌株的制備方法，具體包括下列步驟
1) 將采自陜西楊凌的野生黃花蒿莖組織用清水洗凈后用吸水紙將水分吸 干，在99%乙醇中浸lmin，然后在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再次放 入99%乙醇中浸30 sec，最后用無菌生理鹽水沖洗5次；
2) 將表面消毒后的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片切成0.2mm長的小 段，置于高氏一號平板上，28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 28 d后統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)并用 劃線法進行純化成單菌落；
3) 將純化后的單菌落經(jīng)過如下發(fā)酵將在黃豆粉平板上活化培養(yǎng)5 7d 的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養(yǎng)基中，28°C， 150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養(yǎng)基中，30'C，180r/min發(fā)酵72 96h，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液以10000r/min離心30min，取上清液， 將制得的上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株 TIASA5。
所述的高氏一號由可溶性淀粉20g， KNO3lg，K2HPO40.5g， NaCl 0.5 g， MgS04 7H20 0.5 g， FeS04 7H2O0.01g，瓊脂粉13g，蒸餾水lOOOmL組成， 且pH為7.2。
所述的黃豆粉培養(yǎng)基可容性淀粉5g 、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母膏2 g、 NaCl 2 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04 7H20 0.5 g、 CaC03 lg 、黃豆粉20g煮 沸30min過濾、水1000mL、 pH為7.2 7.4。
本發(fā)明還有一個目的是提供TIASA5菌株的抗菌活性物質(zhì)，它是按照下列 方法制備的-
1) 將TIASA5菌株接在黃豆粉平板上，3(TC活化培養(yǎng)5 7d，將菌苔平板 用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，先將菌餅接入種子培養(yǎng)基(黃豆粉20g，蔗 糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g， NaCl 2g， CaC03 lg， MgS04 7H20 0.5g， KH2PO40.5g，瓊脂15 g，蒸餾水lOOOmL, pH 7.0)中， 28°C， 150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(黃豆 粉15g、淀粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸銨15g、 NaC12g、 K2HPO40.5g、 CaC03 lg、蒸餾水1000mL、 pH 7.0 7.2)中，30°C， 180r/min
發(fā)酵72h;
2) 將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在10000r/min下離心30min，取上清液進行提取前預(yù) 處理，即先用1M H2S04將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值為2， 80'C水浴lh后，再用 1M的NaOH調(diào)至pH值為7，然后以10000r/min的速度離心30min，收集上清液；
3) 將按步驟2)預(yù)處理好的上清液過732#離子交換樹脂柱，動態(tài)吸附，再 用1N的氨水洗脫，根據(jù)薄層檢測和活性跟蹤的結(jié)果收集合并活性餾分；
4) 將活性餾分減壓濃縮后再冷凍干燥即得抗菌活性物質(zhì)。 本發(fā)明還有一個目的是提供TIASA5菌株及其抗菌活性物質(zhì)在防治獼猴桃
細(xì)菌性潰瘍病中的應(yīng)用。
本發(fā)明的TIASA5菌株具有以下特征
A培養(yǎng)特征TIASA5菌株在高氏一號平板上菌落較小，菌落為圓形，凸起， 孢子堆顏色為橄欖灰色，氣生菌絲發(fā)達，基內(nèi)菌絲前期為白色，3 5d后呈絳紅 色，不產(chǎn)生可溶性色素，該菌株在各培養(yǎng)基上都不產(chǎn)生可溶性色素。
B形態(tài)學(xué)特征通過掃描電子顯微鏡對該菌株的菌絲形態(tài)觀察，其氣生菌絲
呈松散的螺旋狀，且菌絲表面有細(xì)長的毛發(fā)狀突起。孢子呈橢圓形，孢子表面 亦有毛發(fā)狀突起。菌絲和孢子的形態(tài)見附見圖1，方法見實施例l。
C生理生化特征生理生化測試結(jié)果表明，TIASA5菌株能使石蕊牛奶變藍(lán) 但不胨化，產(chǎn)淀粉酶能力強，能產(chǎn)生卵磷脂酶和纖維素酶，不產(chǎn)生蛋白酶，不 產(chǎn)生硫化氫和黑色素，硝酸鹽反應(yīng)陽性。TIASA5菌株可以利用的碳源有葡萄糖、 蔗糖、麥芽糖、D-果糖、肌醇、甘露糖、山梨醇、羧甲基纖維素、半乳糖和棉 籽糖，但是不利用甘油；該菌可以利用的氮源有甘氨酸、D，L-a-丙氨酸、L-賴氨 酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸、L-胍氨酸、尿素和L-天門冬氨酸，但不能利用馬尿 酸鈉、L-色氨酸和D,L-酪氨酸。最適生長溫度為3(TC，對pH不敏感。
D細(xì)胞壁糖型和氨基酸分析經(jīng)細(xì)胞壁氨基酸和糖分析，結(jié)果表明該菌株 細(xì)胞壁中含有L，L-DAP和甘氨酸等多種氨基酸，無特征性糖，屬于胞壁I型。本發(fā)明的TIASA5菌株經(jīng)菌落培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)的顯微觀察、細(xì)胞化學(xué) 分析、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，屬于青色鏈霉菌類。
本發(fā)明的TIASA5菌株來自黃花蒿的莖組織，分離篩選方法簡單；TIASA5 菌株產(chǎn)生的抑制獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的主要活性物質(zhì)為堿性水溶性的巴龍霉素 族抗生素，能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。該類抗生素水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、 抗菌譜廣、對葡萄球菌和需氧革蘭氏陰性桿菌均具有良好的抗菌活性，該菌株 是產(chǎn)生此類抗生素菌株的新來源。該菌株分離自健康植物組織內(nèi)，因而產(chǎn)生的 活性代謝產(chǎn)物對植物組織沒有明顯毒害作用，且性質(zhì)穩(wěn)定，噴施方便，防治獼 猴桃潰瘍病效果顯著。


圖1為TIASA5菌株的菌絲形態(tài)及孢子形態(tài)特征圖。
圖2為TIASA5菌株活性粗提物的捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析圖譜寄生物顯影 結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面通過發(fā)明人給出的具體實驗例和試驗例來進一步詳述本發(fā)明的 TIASA5菌株及活性物質(zhì)的制備方法和有益效果。
實施例一TIASA5菌株的分離和形態(tài)鑒定
1) 將采自陜西楊凌的健康野生黃花蒿莖組織用清水洗凈后用吸水紙將水 分吸干，在99%乙醇中浸lmin，然后在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再 次放入99%乙醇中浸30 sec，最后用無菌生理鹽水沖洗5次；
2) 將表面消毒后的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片切成0.2mm長的小 段，置于高氏一號平板上，28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 28 d后統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)并用劃線法進行純化成單菌落；
3)將純化后的單菌落經(jīng)過如下發(fā)酵將在黃豆粉平板上活化培養(yǎng)5 7d
的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養(yǎng)基中，28°C， 150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養(yǎng)基中，30°C， 180r/min發(fā)酵72 96h，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液以10000r/min離心30min,取上清液， 后制得的上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株 TIASA5;
實施例二 TIASA5菌株的抗菌活性物質(zhì)的制備方法
將在黃豆粉平板上活化培養(yǎng)5d的TIASA5菌株用打孔器打成直徑為6mm 的菌餅，接入種子培養(yǎng)基中，28°C， 150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將 種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C， 180r/min發(fā)酵培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在 10000r/min下離心30min，取上清，即為粗發(fā)酵液。將粗發(fā)酵液用1M H2S04調(diào) 至pH2，80。C水浴lh，然后用1M的NaOH調(diào)至pH7，再離心(10000r/min，30min)， 收集上清液，初步除掉發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)和CaC03。將預(yù)處理好的發(fā)酵液上732 "離子交換樹脂，動態(tài)吸附，然后用1N的氨水洗脫，流速為3mL/min，每餾分 收集100mL。根據(jù)活性跟蹤的結(jié)果收集合并活性餾分。將活性餾分減壓濃縮后 再冷凍干燥，得到的固體樣品即為抗菌活性物質(zhì)。
試驗例1 TIASA5菌株對獼猴桃潰瘍菌皿內(nèi)抑制作用以及活性粗提物田間 防治試驗
將在固體黃豆粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d的TIASA5菌株平板用打孔器打成直徑為 6mm的菌餅，接入黃豆粉培養(yǎng)液中培養(yǎng)36h后作為種子液，然后分別按12%的 接種量接入黃豆粉培養(yǎng)液中，30°C， 180r/min條件下培養(yǎng)3d后10000r/min離心30min，取上清液備用。將滅菌牛津杯放入混好獼猴桃潰瘍病菌(10"mL)的NA 平板中央，杯中加入100pL制備的上清液，置30。C培養(yǎng)18 24h后用十字交叉 法測量抑菌圈的大小，試驗設(shè)2個重復(fù)，取其平均值。
田間防治試驗采用實施例二中活性粗提物A5，選取發(fā)病枝條上病斑大小均 勻的病斑作為處理對象，并便每個處理的病斑均勻分布在同一株獼猴桃樹的各 枝條上。試驗設(shè)4個處理，即噴施稀釋100倍粗提物(A5l00x)，稀釋500倍粗提 物(As 500x)，以稀釋150倍的施那寧(施那寧150x)(有效成分為代森銨)為對照農(nóng) 藥，以清水為空白對照。
將選取的病斑用小刀刮去表皮，量取病斑面積，然后將藥劑用噴壺噴灑病 斑處，連續(xù)噴藥2次。然后每隔7天調(diào)查，并測量病斑面積， 一共調(diào)查4次。 試驗每處理為12個病斑，設(shè)3個重復(fù)。
對照防后面積—處理防后面積
相對防效(qo—對照防前面哀處理防前面積::1()()^ 卿雄/。) 對照防后面積 爛/0
對照防前面積
TIASA5菌株的無菌發(fā)酵濾液對供試的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均 有很強的抑制作用，其抑菌效果見表l。
表1 TIASA5菌株發(fā)酵液對靶標(biāo)細(xì)菌的抑菌作用
靶標(biāo)菌 抑菌圈直徑(mm) 耙標(biāo)菌 抑菌圈直徑(mm)
枯草芽孢桿菌 37.5±0.1 獼猴桃潰瘍菌 32.0±0.1
金黃色葡萄球菌35.0±0.2 白菜軟腐菌 25.5±0.2
大腸桿菌32.0±0.1 番茄青枯菌 o
田間試驗結(jié)果表明，稀釋100倍和稀釋500倍的A5粗提物菌對獼猴桃潰瘍
病表現(xiàn)較好的防治效果，在施藥21d后，相對防效達到最大(見表2)，其對獼
11猴桃潰瘍病的相對防效分別為61.5%和42.2%，而用施納寧處理的相對防效為 30.8%，且差異顯著。
表2 TIASA5菌株發(fā)酵液粗提物對獼猴桃潰瘍病的田間防治效果
處理7d14d相對防效C5/。) 21d28d
A5,謂x33.7a47.4a61.5a58.4a
A5, 500x16.1c31.4b42.2b49.8a
45°/。施那寧，150x21.5b27.7b30.8c28.6b
試驗例2: TIASA5菌株的活性4f質(zhì)的性質(zhì)預(yù)試
采用捷克八溶劑系統(tǒng)紙層析試驗取18x0.5cm的濾紙條，在其下端5cm處 點上適當(dāng)?shù)臉悠?采用實施例二中活性粗提物A5)，分別掛在裝有展開劑的層析 缸中，使有樣品一端浸入溶劑約lcm深度。待溶劑擴展到紙條上端3cm處取下， 風(fēng)干，平鋪在混有枯草芽孢桿菌的NA平板上，置4'C冰箱滲透3h后揭開濾紙 條，然后置3(TC培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 24h，觀察結(jié)果見(圖2a:紙層析圖譜，b:生 物顯影)，記錄抑菌圈中心距點樣原點的距離，計算各自的Rf值。Rf二樣品由 原點到抑菌圈中心的距離/溶劑由原點到溶劑前沿的距離。將各展開劑中展開的 Rf值連成的折線圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進行比較發(fā)現(xiàn)，TIASA5發(fā)酵液的圖譜與標(biāo)準(zhǔn) 圖譜中的第一大類抗生素圖譜，即在第5,6種展開系統(tǒng)中的Rf值較大，因此推 斷TIASA5菌株發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)屬于堿性水溶性抗生素-氨基糖苷類抗 生素，進一步分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果表明主要抗菌活性物質(zhì)為巴龍霉素。
1權(quán)利要求
1. 楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5GCMCC No.2132。
2. 制備權(quán)利要求1所述的楊凌青色鏈霉菌TIASA5菌株的方法，其特征在于，具體包括以下步驟1)將采自陜西楊凌的野生黃花蒿莖組織用清水洗凈后用吸水紙將水分吸干，在99%乙醇中浸lmin，然后在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再次放入99。/。乙醇中浸30sec，最后用無菌生理鹽水沖洗5次；2) 將表面消毒后的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片動成0.2mm長的小段，置于高氏一號平板上，28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 28 d后統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)并用劃線法進行純化成單菌落；3) 將純化后的單菌落經(jīng)過如下發(fā)酵將在黃豆粉平板上活化培養(yǎng)5 7d的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養(yǎng)液中，28°C，150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養(yǎng)基中，30°C，180r/min發(fā)酵72 96h，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液以10000r/min離心30min，取上清，將制得的發(fā)酵上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株TIASA5;所述的高氏一號由可溶性淀粉20g， KNO3lg，K2HPO40.5g, NaC10.5g，MgSCX 7H20 0.5 g， FeS04 7H20 O.Olg，瓊脂粉13g，蒸餾水lOOOmL組成，且pH為7.2;所述的黃豆粉培養(yǎng)基可容性淀粉5g 、蔗糖10g、蛋白胨2g、酵母膏2g、NaCl 2 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04 7H20 0.5 g、 CaC03 lg 、黃豆粉20g煮沸30min過濾、蒸餾水1000ml、 pH為7.2 7.4。
3.權(quán)利要求1所述的楊凌青色鏈霉菌TIASA5菌株的抗菌活性物廣，其特征在于，它是按照下列方法制備的1) 將楊凌青色鏈霉菌TIASA5菌株接在黃豆粉平板上，30。C活化培養(yǎng)5 7d，將菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，先將菌餅接入種子培養(yǎng)基中，28°C， 150r/min培養(yǎng)36h后，按12%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30。C， 180r/min發(fā)酵72h;2) 將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在10000r/min下離心30min，取上清液進行提取前預(yù)處理，即先用1MH2S04將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值為2， 8(TC水浴lh后，再用1M的NaOH調(diào)至pH值為7，然后以10000r/min的速度離心30min，收集上清液；3) 將按步驟2)預(yù)處理好的上清液過732#離子交換樹脂柱，動態(tài)吸附，再用1N的氨水洗脫，根據(jù)薄層檢測和\活性跟蹤的結(jié)果收集合并活性餾分；4) 將活性餾分減壓濃縮后再冷凍干燥即得抗菌活性物質(zhì)；所述的種子培養(yǎng)基由黃豆粉20g，蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母浸粉2g， NaC12g， CaC03lg， MgS04'7H20 0.5g， KH2PO40.5g，瓊脂15 g，蒸餾水1000mL組成，其pH為7.0;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基由黃豆粉15g、淀粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸銨15g、 NaC12g、 K2HP04 0.5 g、 CaC03 lg、蒸餾水1000mL組成，其pH 7.0-7.2。
4.權(quán)利要求1所述的楊凌青色鏈霉菌TIASA5菌株在防治獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述的楊凌青色鏈霉菌TIASA5菌株的抗菌活性物質(zhì)在防治
全文摘要
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5菌株的鑒定及其活性物質(zhì)的制備方法和應(yīng)用，該菌株已于2007年8月16日保藏在中國科學(xué)院微生物所菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為GCMCC No.2132。該菌株對獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病具有較好的防治作用。該菌株分離自植物組織內(nèi)，其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物對植物組織沒有毒害作用，且性質(zhì)穩(wěn)定，噴施方便，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N1/20GK101486982SQ20091002108
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者康振生, 璇 涂, 哲 申, 高小寧, 黃麗麗 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)