miR1432在水稻干旱脅迫中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及miR1432在水稻干旱脅迫中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Ca2+在植物細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中居于中心位置，是胞內(nèi)重要的信號分子，它在植物生長 發(fā)育以及逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物在遭受不同的脅迫時，大都需要通過改變胞 內(nèi)鈣離子濃度來調(diào)動不同的生理過程以應(yīng)對逆境。而胞內(nèi)鈣離子濃度[Ca2+Lyt的變化主要 依靠膜上鈣離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來實現(xiàn)，該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對于[Ca2+Lyt的平衡起到關(guān)鍵作用。最近，有 研究指出，在動物和番茄中某些miRNA可以靶向調(diào)控膜上鈣離子轉(zhuǎn)運基因，影響動、植物的 生長發(fā)育。但到目前為止，除了番茄外，其它植物中都未見相關(guān)的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供miR1432或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體、 表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒的用途。
[0004] 本發(fā)明提供了miR1432或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn) 基因細胞系、重組菌或重組病毒在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用；
[0005] 所述miR1432的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供miR1432或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載 體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒的用途。
[0007] 本發(fā)明提供了miR1432或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn) 基因細胞系、重組菌或重組病毒在培育高抗旱性植物中的應(yīng)用。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0009] 或所述植物為單子葉植物，所述雙子葉植物為水稻。
[0010] 抑制miR1432表達的物質(zhì)在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0011] 抑制miR1432表達的物質(zhì)在提高植物抗旱性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述抑制miR1432表達的物質(zhì)為如下1)或2):
[0013] 1)核苷酸序列為序列3的DNA片段；
[0014] 2)含有1)的組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒。
[0015] 上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0016] 或所述植物為單子葉植物，所述雙子葉植物為水稻。
[0017] 本發(fā)明第三個目的是提供一種培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0018] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：抑制目的植物中miR1432表達，得到轉(zhuǎn)基因植 物；
[0019] 所述轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性高于所述目的植物。
[0020] 上述方法中，所述抑制目的植物中miR1432表達為將抑制miR1432表達的物質(zhì)導(dǎo) 入目的植物。
[0021] 上述方法中，所述抑制miR1432表達的物質(zhì)為如下1)或2):
[0022] 1)核苷酸序列為序列3的DNA片段；
[0023] 2)含有1)的組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒；
[0024] 所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0025] 或所述植物為單子葉植物，所述雙子葉植物為水稻。
[0026] 本發(fā)明第四個目的是提供一種抑制miR1432表達的物質(zhì)。
[0027] 本發(fā)明提供的抑制miR1432表達的物質(zhì)，為如下1)或2):
[0028] 1)核苷酸序列為序列3的DNA片段；
[0029] 2)含有1)的組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒。
[0030] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過干擾野生型水稻中的miR1432的表達，得到轉(zhuǎn)基 因水稻，其與未干擾的野生型水稻相比，抗干旱脅迫。因此，miR1432可用于水稻高抗旱育 種，豐富現(xiàn)有的水稻育種材料的遺傳多樣性。
【附圖說明】
[0031] 圖1為miR1432靶基因鑒定。
[0032] 圖2為0E-miR1432干旱脅迫表型分析。
[0033] 圖3為0E-miR1432干旱脅迫表型分析。
[0034] 圖4為0E-eTM1432干旱脅迫表型分析。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037] 實施例l、miR1432的功能驗證
[0038] l、miR1432靶向調(diào)控基因的確定
[0039] 將通過PsRobot(http://omicslab.genetics,ac.cn/psRobot/)中microRNA革巴基 因預(yù)測工具，預(yù)測miR1432的靶基因，然后利用Ambion公司的RLM-RACE試劑盒（AM1700) 進行5'RACE，進一步驗證miR1432的靶基因。
[0040] MiRNA通常需要通過其調(diào)控靶基因來參與生物學(xué)過程，為了研究miR1432的功 能，首先通過軟件psRobot預(yù)測其靶基因，然后通過RLM-5'RACE實驗驗證，一類鈣栗基因 (3 個ACA基因能被miR1432 靶向調(diào)控，它們是L0C_0s02g08010、L0C_0s04g51610 和L0C_ 0s08g40530。RLM-5'RACE得到的特異性片段測序顯示miR1432介導(dǎo)的靶基因mRNA的切割 位置如圖1所示。
[0041] 2、miR1432基因的獲取
[0042] 根據(jù)水稻基因組序列設(shè)計miR1432的特異引物P1和P2,引物序列如下：
[0043] miR1432-Pl：ATCTAGAATGAGGGAGGATGTGCGTTC
[0044] miR1432-P2：TCTGCAGGAAACCGAAGAATCATCGAGG
[0045] 提取日本晴水稻（0·SativaL.spp.japonica，varnipponbare，以下也稱為野 生型水稻；LossofFunctionofOsDCLIAffectsMicroRNAAccumulationandCauses DevelopmentalDefectsinRice,PlantPhysiology, 2005,V139 (1)296-305;公眾可從中 國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得）的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，用miR1432-Pl和miR1432-P2進行PCR擴增，得到207bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該擴增產(chǎn)物具有序列表中 序列2,為miR1432基因，編碼miR1432,其核苷酸序列為序列1。
[0046] 上述擴增反應(yīng)體系如下表1 :
[0047] 表1為擴增反應(yīng)體系
[0048]
[0049] 上述擴增反應(yīng)程序如下表2 :
[0050] 表2為擴增反應(yīng)程序
[0051]
[0052] 3、miR1432過表達載體的構(gòu)建
[0053] 將上述2獲得的PCR產(chǎn)物用XbaI和PstI限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)過同樣酶切的 表達載體PCAMBIA2300 (購自CAMBIA，澳大利亞）連接，得到重組載體，命名為0E-miR1432， 表達miR1432,該重組載體為將序列2所示的DNA分子替換表達載體pCAMBIA2300的XbaI 和PstI酶切位點間的DNA片段。
[0054] 4、miR1432敲低表達載體的構(gòu)建
[0055] 在水稻基因組上通過miR1432的targetmimic的分析，發(fā)現(xiàn)了 一個可以通過 targetmimicry方式負向調(diào)控miR1432的序列，設(shè)計擴增這段序列的特異引物：
[0056] eTM1432-Pl:ATCTAGAGGTAGGTGTGGCGCGGTATT
[0057] eTM1432-P2:TCTGCAGCGAGTGGTTCGGCAAGGGGA
[0058] 提取日本晴水稻（0·SativaL.spp.japonica，varnipponbare，以下也稱為野 生型水稻；LossofFunctionofOsDCLIAffectsMicroRNAAccumulationandCauses DevelopmentalDefect