一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅dreb2基因的篩選試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種早期旱脅迫高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法。本發(fā)明以PEG6000旱脅迫處理(0h、6h、12h、18h和24h)的高羊茅為實驗材料，利用Illumina/Solexa測序平臺的RNA-seq技術(shù)進行混合轉(zhuǎn)錄組測序分析，以已登記的DREB2基因序列為探針進行本地Blast(Local?Blast)，篩選早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2基因。本發(fā)明方法可以快速、全面的篩選旱脅迫誘導(dǎo)的高羊茅DREB2候選基因，對抗旱機制研究和植株抗性分子育種具有重要指導(dǎo)意義。
【專利說明】一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DREB2s (Dehydration Responsive Element Binding Protein2)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要作用。Liu等和Kasuga等首次從擬南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.]中克隆得到了 DREB2A轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)其與干旱應(yīng)答兀件 CRT/DRE (C-Repeat/Dehydration-Responsive Element,核心序列:A/GCCGAC)或GCC-BOX(核心序列:TAGCCGCCA)特異性結(jié)合，參與調(diào)控干旱、高鹽和低溫等耐性相關(guān)基因的表達，在植物的非生物脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。在GenBank數(shù)據(jù)庫注冊的編碼DREB2S序列涉及20多個物種，這其中包括模式植物、重要的大田作物和旱鹽脅迫生境條件下生長的植物，目前人們更熱衷于在逆境適應(yīng)性強的植物材料中挖掘新的DREB2基因，DREB2s基因功能及調(diào)控機制的研究則主要以模式植物擬南芥為研究對象。DREB2s促使下游含DRE元件的脅迫誘導(dǎo)基因發(fā)揮作用，使植物的抗逆性得到綜合改良。Qin等將玉米ZmDREB2A轉(zhuǎn)化到擬南芥，發(fā)現(xiàn)其過量表達能夠激活下游HSPs和HsfA3等熱激相關(guān)基因的表達，轉(zhuǎn)ZmDREB2A植物的耐旱和耐熱性提高。PgDREB2A可以增加轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽和抗旱性，并且在滲透脅迫和熱脅迫條件可以上調(diào)下游基因，轉(zhuǎn)PgDREB2A煙草耐鹽性、抗熱性顯著提高，而TO代種子產(chǎn)量和植株表型與野生型無異。但是，植物中過量表達有些來源的DREB2s，在提 高植株抗逆性的同時，會對植物產(chǎn)生一定的毒害作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物生長遲緩，影響植物的生長發(fā)育，表現(xiàn)為生長的延遲及植株的矮化。Sakuma等對轉(zhuǎn)基因植株生長遲緩原因研究時發(fā)現(xiàn)，使用誘導(dǎo)型啟動子RD29A可以避免AtDREB2A過量表達引起的生長遲緩。35S:AtDREB2A CA轉(zhuǎn)基因植株生長矮化，而且矮化程度與AtDREB2A CA和其下游功能基因RD29A的表達水平成正比，而轉(zhuǎn)全長基因的35S:AtDREB2A FL轉(zhuǎn)基因植株的生長矮化現(xiàn)象不明顯。
[0003]高羊茅(Festucaarundinacea = Lolium arundinaceum)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國目前使用量增長最快的草種，在我國大部分地區(qū)可以栽培，是南方地區(qū)綠期最長的冷季型草坪。高羊茅的夏季生長需水量較大，夏季干旱和高溫環(huán)境條件是限制其生長的主要因素。提高環(huán)境的適應(yīng)性，培育節(jié)水、耐旱抗高溫型品種是目前高羊茅育種的主要目標之一。植物抗逆性狀非常復(fù)雜，往往與數(shù)量性狀位點連鎖，而高羊茅的遺傳背景復(fù)雜(PPGlG2G3G4，2n = 6x = 42)，基因組較大(5.27~5.83X 106kb)，且為種子繁殖為主的異花授粉植物，采用傳統(tǒng)的選擇育種獲得的品種(品系)多為異質(zhì)雜合群體，選育周期長，性狀不穩(wěn)定，獲得優(yōu)良抗性品種十分困難。隨著植物分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改良高羊茅性狀成為可能。DREB2S轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控下游大量逆境脅迫基因的表達，利用該轉(zhuǎn)錄因子有望綜合改良植物的抗逆性。因此，對具有產(chǎn)業(yè)化潛力的DREB2轉(zhuǎn)錄因子進行基因功能和抗逆調(diào)控機制研究，利用它們改造高羊茅，將有助于高羊茅等草坪植物的抗逆基因工程育種。
[0004]與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的方法(基因芯片技術(shù)、SAGE技術(shù)和MPSS技術(shù)、EST技術(shù)、高密度全基因組芯片)相比，RNA-Seq技術(shù)是全新的轉(zhuǎn)錄組研究方法，可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，用序列片段的數(shù)量表示基因的轉(zhuǎn)錄水平，能夠檢測可變剪接和新基因，對轉(zhuǎn)錄體結(jié)構(gòu)的分析有了明顯的提高，而且不同批次樣品間基因表達的數(shù)據(jù)易于進行比較。這些獨特的優(yōu)勢，使得RNA-Seq技術(shù)成為目前深入研究生物體轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強大工具。
[0005]利用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)分析高羊茅DREB2轉(zhuǎn)錄因子，為揭示高羊茅DREB2候選基因、剖析DREB2參與的植物抗逆調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)提供了新的思路，將加快FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育種的步伐。
[0006]數(shù)字基因表達譜(Digital Gene Expression Profiling, DGE)是利用高通量測序，系統(tǒng)、快速地檢測某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達情況的技術(shù)。DGE已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域。已有研究報道利用DGE對黃肉獼猴桃果實著色過程中相關(guān)差異基因、脂多糖活化巨噬細胞的基因表達、莖瘤芥根和莖組織轉(zhuǎn)錄組比較和小尾寒羊高繁性狀相關(guān)基因的篩選和解析研究。
[0007]本地Blast (Local Basic Local Alignment Search Tool)是在本地化的蛋白質(zhì)或DNA數(shù)據(jù)庫中進行相似性序列比較的工具，已經(jīng)被用于某一物種特定組織中某一個或家族的基因篩選。已有研究報道利用擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因序列為探針，對蘋果全基因組序列執(zhí)行本地Blast搜索，結(jié)合生物信息學(xué)方法來篩選蘋果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因；以擬南芥和水稻ANK家族基因序列執(zhí)行本地Blast搜索‘金冠’蘋果全基因組序列，結(jié)合結(jié)構(gòu)域搜索工具⑶(conserved donmain)、perl程序等生物信息學(xué)方法,解析蘋果錨蛋白基因ANK家族基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明旨在針對目前高羊茅抗旱分子機制相關(guān)信息的匱乏，提供一種早期旱脅迫高羊茅DREB2基因的篩選試劑盒及方法。
[0009]為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0010]所述早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒，所述試劑盒包括表1所述的探針(共38條):
[0011]表1
【權(quán)利要求】
1.一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括具有如下登錄號的探針:
AT1G06770
AT1G21910
AT1G75490
AT2G30580
AT2G38340
AT2G40340
AT2G40350
AT3G11020
AT3G23060
AT3G57600
AT5G03720
AT5G05410
AT5G18450
G1:38099059
G1:66710525
61:71534115
61:71534117
G1:169786768
G1:169786766
61:169786764
G1:169786762
G1:169786760
G1:169786758
G1:169786756
G1:169786754
G1:169786752
G1:169786750
G1:169786748
G1:169786746
G1:169786744
61:331123577
61:331123576
61:331123574
61:331123571
G1:374721234
G1:374721232
G1:374721228G1:374721226ο
2.如權(quán)利要求1所述探針在制備早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2候選基因的篩選試劑中的應(yīng)用。
3.一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅DREB2候選基因的篩選方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)將50d齡的高羊茅植株根系分別浸泡在質(zhì)量百分比濃度為20%的PEG6000中Oh，6h，12h，18h和24h ;其中，Oh為對照組，6h、12h、18h和24h為處理組； (2)用Trizol法分別提取經(jīng)步驟(1)模擬旱脅迫處理后的高羊茅葉片的RNA，各處理和對照組的混合RNA作為總轉(zhuǎn)錄組測序的樣本來源；采用高通量測序技術(shù)平臺IlluminahiSeq?2000進行轉(zhuǎn)錄組深度測序，得到若干讀段原始數(shù)據(jù)，將所得的讀段原始數(shù)據(jù)進行過濾，過濾原則為:①去除包含接頭的讀段過濾時使用的接頭序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 ;②去除含有未知堿基比例10%以上的讀段；③去除低質(zhì)量且堿基大于50%的讀段，所示低質(zhì)量是指質(zhì)量值小于5的讀段去除平均質(zhì)量值小于15的讀段，得到可用讀段，然后對可用讀段進行de novo拼接后組裝得到高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組庫，高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組庫中獨立基因的平均長度為691bp，N50長度為1279bp ； (3)采用權(quán)利要求1所述的探針對高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組庫進行LocalBlast分析，設(shè)置Local Blast分析的輸出結(jié)果e-value閾值為le_5,篩選DREB2獨立基因； (4)將步驟(1)所述的4個處理組分別與對照組進行數(shù)字基因表達譜分析；獨立基因表達量統(tǒng)計分析使用RPKM法，計算得到體現(xiàn)基因表達量的差異基因數(shù)據(jù)庫，其計算公式為:
【文檔編號】C12Q1/68GK104004848SQ201410254825
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】張志飛, 張瑜, 王增裕, 陳桂華, 趙志麗 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所