一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅滯綠基因sgr基因的篩選試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高羊茅滯綠基因SGR基因的篩選試劑盒及方法。本發(fā)明以PEG6000旱脅迫處理(0h、6h、12h、18h和24h)的高羊茅為實(shí)驗(yàn)材料，利用Illumina/Solexa測(cè)序平臺(tái)的RNA-seq技術(shù)建立高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，以已登記的來源于18個(gè)物種的51個(gè)SGR序列為探針，應(yīng)用本地Blast(Local Blast)篩選在早期旱脅迫下的高羊茅SGR基因。本發(fā)明方法可以快速、全面的篩選在早期旱脅迫下的高羊茅SGR候選基因，對(duì)選育延長(zhǎng)草坪草綠色期的分子育種具有重要指導(dǎo)意義。
【專利說明】-種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅滯綠基因SGR基因的篩選試劑 盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高羊茅SGR候選基因的篩選試劑盒及方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 滯綠（staygreen)是指植物在衰老過程中葉綠素不降解或降解不明顯的現(xiàn)象， 其最顯著的特征是植株生育末期葉片保持綠色的時(shí)間較長(zhǎng)，甚至完全不黃化。SGR基因在 高等綠色植物中相繼被克隆出來。早期研究主要是通過經(jīng)典定位法，即遺傳分析后，通過 定位的染色體區(qū)域測(cè)序進(jìn)行基因鑒定，再通過突變體互補(bǔ)驗(yàn)證。這些新發(fā)現(xiàn)的SGR基因主 要由核基因編碼并受衰老特異誘導(dǎo)表達(dá)，大多數(shù)來源于C型滯綠突變體，C型滯綠突變體 的葉綠素降解功能因?yàn)檫z傳變異而異常，其葉綠素含量可以長(zhǎng)期維持不變，但是，在生理 功能退化方面與野生型無異，如擬南芥的突變體nye-1，水稻的突變體sgr和nyc3,辣椒 (Capsicumannuum)的突變體cl，豌豆（Pisumsativum)的突變體JI2775,番爺（Solanum lycopersicon)的突變體gf，柑橘（Citrussinensis)的突變體nan，漢藜苜猜（Medicago truncatula)的突變體sgr等。
[0003] 已知的SGR蛋白結(jié)構(gòu)中不包含任何已知的結(jié)構(gòu)域，因此尚無法判斷SGR可能的作 用途徑。不過可以明確的是，與水溶性葉綠素結(jié)合蛋白相比，SGR無法結(jié)合葉綠素，因此， SGR不是參與葉綠素代謝過程的酶。Park等通過研究水稻的sgr (stay green)突變體發(fā)現(xiàn) 了OsSGR基因，并且發(fā)現(xiàn)該突變體中Psll捕光-葉綠素（LHCII-Chi)復(fù)合體有積累效應(yīng)， 推測(cè)SGR基因作用于LHCII，是調(diào)控LHCII復(fù)合體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因子。在植物發(fā)生衰老時(shí)， 位于葉綠體的SGR結(jié)合并形成SGR-LHCII復(fù)合體從而將LHCII-Chl復(fù)合體結(jié)構(gòu)拆分，其他 參與到葉綠體代謝途徑中的分解蛋白酶便能夠找到并結(jié)合到相應(yīng)的亞基上進(jìn)行下一步的 降解活動(dòng)。因此，就目前的研究推測(cè)，LHCII-Chl復(fù)合體的解離是葉綠素降解途徑的前提， 而SGR可能是參與LHCII-Chi拆卸的候選蛋白質(zhì)。
[0004] 高羊茅（Festucaarundinacea)是禾本科羊茅屬多年生草本植物，是我國(guó)目前使 用量增長(zhǎng)最快的草種，在我國(guó)廣泛栽培，是南方地區(qū)綠期最長(zhǎng)的冷季型草坪。冷劑型草坪 草在夏季的"休眠"現(xiàn)象是生產(chǎn)利用中的主要限制因素。人們?cè)诓萜翰莘N選擇時(shí)更傾向于 綠期長(zhǎng)的草種。SGR突變體雖然不能延長(zhǎng)植物的光合作用，但表型變化可以滿足人們對(duì)綠 色期延長(zhǎng)的追求，所以延長(zhǎng)綠色期是所有草坪草選育的主要目標(biāo)之一。目前僅有研究報(bào)道 1 個(gè)高羊茅滯綠基因SGR候選基因senescence-induciblechloroplastnon-yellowing proteinl(GenBank:ADV57294. 1)，高羊茅SGR的分子基礎(chǔ)和調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)信息匱乏。
[0005] 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組分析方法已經(jīng)從微陣列技術(shù)，SAGE及 MPSS技術(shù)的低通量模式改變成RNA-seq的高通量模式。RNA-Seq(RNA序列分析技術(shù)即全轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序），具有明顯的優(yōu)勢(shì)，僅需要較少的RNA樣品，就可對(duì)某個(gè)物種或者特定細(xì)胞類型 的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，更精確的揭不序列變化、基因表達(dá)的完整注釋、基因在樣品間的 差異表達(dá)分析和檢測(cè)可變剪接等，使整個(gè)轉(zhuǎn)錄組以高通量和定量的方式加以調(diào)查。這些獨(dú) 特的優(yōu)勢(shì)，使得RNA-Seq技術(shù)成為目前深入研究生物體轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具，也被認(rèn) 為是一種發(fā)現(xiàn)新基因的有效手段之一。
[0006] 數(shù)字基因表達(dá)譜（DigitalGeneExpressionProfiling,DGE)是利用高通量測(cè)序， 系統(tǒng)、快速地檢測(cè)某一物種特定組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)情況的技術(shù)。DGE已被廣泛應(yīng) 用于基礎(chǔ)科學(xué)研究領(lǐng)域。已有研究報(bào)道利用DGE對(duì)黃肉獼猴桃果實(shí)著色過程中相關(guān)差異基 因、脂多糖活化巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)、莖瘤芥根和莖組織轉(zhuǎn)錄組比較和小尾寒羊高繁性狀 相關(guān)基因的篩選和解析研究。
[0007]本地Blast(LocalBasicLocalAlignmentSearchTool)是在本地化的蛋白質(zhì)或 DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性序列比較的工具，已經(jīng)被用于某一物種特定組織中某一個(gè)或家族 的基因篩選。已有研究報(bào)道利用擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因序列為探針，對(duì)蘋果全基 因組序列執(zhí)行本地Blast搜索，結(jié)合生物信息學(xué)方法來篩選蘋果WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因； 以擬南芥和水稻ANK家族基因序列執(zhí)行本地Blast搜索'金冠'蘋果全基因組序列，結(jié)合結(jié) 構(gòu)域搜索工具⑶(conserveddonmain)、perl程序等生物信息學(xué)方法，解析蘋果錨蛋白基因 ANK家族基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明旨在針對(duì)目如_羊矛SGR分子機(jī)制相關(guān)"[目息的匱乏，提供一種_羊矛SGR 基因的篩選試劑盒及方法。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] 所述高羊茅SGR候選基因的篩選試劑盒，所述試劑盒包括表1所述的探針（共51 條）：

【權(quán)利要求】
1. 一種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅滯綠基因 SGR基因的篩選試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包括具有如下登錄號(hào)的探針：

2. 如權(quán)利要求1所述探針在制備早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅滯綠基因 SGR候選基因的篩選 試劑中的應(yīng)用。
3. -種早期旱脅迫誘導(dǎo)高羊茅滯綠基因 SGR候選基因的篩選方法，其特征在于，所述 方法包括如下步驟： (1) 以質(zhì)量百分比濃度為20 % PEG6000旱脅迫處理50d齡高羊茅根系Oh，6h，12h，18h 和24h ;其中，Oh為對(duì)照組，6h、12h、18h和24h為處理組； (2) 用Trizol法分別提取經(jīng)步驟（1)旱脅迫處理后的高羊茅葉片的RNA，各處 理和對(duì)照組的混合RNA作為總轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本來源；采用高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái) IllUminahiSeqTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，得到若干讀段原始數(shù)據(jù)，將所得的讀段原始數(shù) 據(jù)進(jìn)行過濾，過濾原則為：①去除包含接頭的讀段過濾時(shí)使用的接頭序列SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 ;②去除含有未知堿基比例10%以上的讀段；③去除低質(zhì)量且堿基大于50%的 讀段，所示低質(zhì)量是指質(zhì)量值小于5的讀段；④去除平均質(zhì)量值小于15的讀段，得到可用讀 段，然后對(duì)可用讀段進(jìn)行de novo拼接后組裝得到高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組庫(kù)，高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組 庫(kù)中獨(dú)立基因的平均長(zhǎng)度為691bp，N50長(zhǎng)度為1279bp ; (3) 采用權(quán)利要求1所述的探針對(duì)高羊茅混合轉(zhuǎn)錄組庫(kù)進(jìn)行Local Blast分析，設(shè)置 Local Blast分析的輸出結(jié)果e-value閾值為le_5,篩選出優(yōu)勢(shì)表達(dá)的SGR基因； (4) 將步驟（1)所述的4個(gè)處理組分別與對(duì)照組進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜分析；獨(dú)立基因 表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析使用RPKM法，計(jì)算得到體現(xiàn)基因表達(dá)量的差異基因數(shù)據(jù)庫(kù)，其計(jì)算公式 為：
設(shè)RPKM為獨(dú)立基因的表達(dá)量，C為唯一比對(duì)到獨(dú)立基因的讀段數(shù)，N為唯一比對(duì)到所有 獨(dú)立基因的總讀段數(shù)，L為獨(dú)立基因的堿基數(shù)；RPKM法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì) 算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異； (5) 以步驟（4)獲得的各處理的差異基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析步驟（3)獲得的SGR獨(dú)立基因，進(jìn) 一步篩選旱脅迫下特異表達(dá)的SGR基因。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328165SQ201410254832
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】張志飛, 王增裕, 趙志麗, 劉明稀, 文昭竹 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)