一種應(yīng)用混合樹脂分離純化蟲草素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥工業(yè)或功能食品工業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從蛹蟲草子實(shí)體或其培養(yǎng)基中提取純化蟲草素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]北冬蟲夏草簡稱北蟲草，也稱蛹蟲草或蛹草，是蟲菌結(jié)合的藥用真菌，現(xiàn)代珍稀中草藥，有〃甘平保肺、益腎、補(bǔ)精髓、止血化痰〃等療效。近年來，國內(nèi)外市場對冬蟲夏草的需求越來越大，導(dǎo)致野生冬蟲夏草資源由于過度開采而變得十分稀缺，價格也是不斷上漲。鑒于此，人工蛹蟲草的培養(yǎng)、提取純化以及應(yīng)用開發(fā)等方面的研究愈來愈倍受企業(yè)和學(xué)者的關(guān)注。蟲草素是蛹蟲草最有代表性的有效或活性成分之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞等功效，天然蟲草素的主要來源是蛹蟲草。吸附樹脂在20世紀(jì)70年代末開始應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離，我國主要用于醫(yī)藥工業(yè)及天然活性物質(zhì)的提純和中草藥有效成分的分離純化，在蟲草素的分離純化方面有離子交換樹脂吸附、活性炭吸附、氧化鋁柱層析、硅膠柱層析和超臨界流體萃取等，然而應(yīng)用混合樹脂進(jìn)行分離純化的研究尚不多見。不同的吸附樹脂其物理性能(比表面積和孔徑的大小)，以及樹脂結(jié)構(gòu)(功能基團(tuán)等)方面可能有所不同，其對目標(biāo)化合物如蟲草素所表現(xiàn)出的吸附及解吸性能便有所不同。本發(fā)明將不同性能、類型的樹脂進(jìn)行混合，通過混合樹脂吸附和洗脫來達(dá)到分離純化蟲草素的目的，提高提取液浸膏中蟲草素的含量。
[0003]研究表明，蛹蟲草在培養(yǎng)完成后的固體培養(yǎng)殘基中仍含有一些活性成分，其中蟲草素的含量與子實(shí)體中蟲草素的含量相當(dāng)，但目前除少量培養(yǎng)殘基用作飼料外，大部分被生產(chǎn)者廢棄。因此，研究如何從固體培養(yǎng)殘基中簡便高效地提取純化蟲草素等活性成分，對提高蛹蟲草資源綜合利用率，促進(jìn)蛹蟲草高附加值副產(chǎn)品的開發(fā)利用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]目前利用大孔吸附樹脂或離子交換樹脂分離純化蟲草素的研究較多，但利用混合樹脂進(jìn)行分離純化的報道較少，本發(fā)明提供一種利用混合樹脂分離純化蟲草素的方法。其特征在于:不僅可以蛹蟲草子實(shí)體為原料，也可以蛹蟲草固體培養(yǎng)基或培養(yǎng)完成后的固體培養(yǎng)殘基為原料，降低了生產(chǎn)蟲草素的成本，提高了資源綜合利用率，改善了生態(tài)環(huán)境。采用混合樹脂吸附解吸附，結(jié)合硅膠柱層析等精制方法，可制備出高純度的蟲草素產(chǎn)品。
[0005]本發(fā)明提供的利用混合樹脂分離純化蟲草素的方法，具體步驟如下:
1.原料預(yù)處理以蛹蟲草子實(shí)體或蛹蟲草固體培養(yǎng)基為原料，于60 °C下真空干燥，粉碎后過篩，選取60-100目樣品顆粒，準(zhǔn)備脫脂處理。
[0006]2.脫脂由于蛹蟲草子實(shí)體或固體培養(yǎng)基中含有蛋白、脂肪或培養(yǎng)液等營養(yǎng)物質(zhì)，需進(jìn)行脫脂處理后再提取蟲草素。向干燥粉碎后的培養(yǎng)基顆粒中加入10-30倍量的石油醚進(jìn)行回流脫脂1-3 h，或者于50 °C下在恒溫振蕩器中振蕩脫脂1-3 h，脫脂樣品經(jīng)過濾風(fēng)干后備用。
[0007]3.蟲草素提取稱取一定量經(jīng)預(yù)處理后的蛹蟲草子實(shí)體或固體培養(yǎng)基，加入8?30倍量的提取液，提取溶劑為純水或乙醇水溶液(乙醇含量10-70%，v/v),以微波、超聲波、恒溫振蕩或水熱回流法進(jìn)行蟲草素提取。平行提取2次，合并提取濾液，如為純水提取液，則醇沉除去多糖，減壓回收乙醇，加水稀釋定容，作為蟲草素粗提取液備用。
[0008]4.混合樹脂純化分別稱取幾種預(yù)先篩選出的大孔吸附樹脂或離子交換樹脂，對樹脂進(jìn)行預(yù)處理，除去樹脂生產(chǎn)過程中殘留的有機(jī)溶劑。將預(yù)處理好的幾種樹脂按一定比例進(jìn)行混合后填裝樹脂層析柱，或按樹脂的極性等吸附性能的不同，分層填裝樹脂柱，控制蟲草素粗提取液的上柱吸附流速為2-10 BV/KBV為樹脂床體積)，以高效液相色譜儀(簡稱HPLC，配紫外檢測器或光電二極管陣列檢測器)檢測上柱吸附殘液中蟲草素的含量。待吸附達(dá)平衡后，加入10-70%乙醇溶液(大孔吸附樹脂)或0.05-1.0 mol/L氨性乙醇溶液(離子交換樹脂，乙醇含量10-70%)進(jìn)行洗脫，洗脫液流速1-3 BV/h，每1-2 BV收集一份洗脫液，以HPLC檢測洗脫液中蟲草素的含量，檢測波長259 nm。
[0009]5.濃縮干燥按HPLC檢測結(jié)果，將混合樹脂床洗脫液中蟲草素含量較高且接近的洗脫部分進(jìn)行合并，減壓蒸餾除去乙醇，濃縮至近干，在60 °C下真空干燥，可得到蟲草素含量為20-40%的浸膏。
[0010]6.精制經(jīng)濃縮干燥后的提取物浸膏，以硅膠柱層析、聚酰胺柱層析或乙醇等有機(jī)溶液結(jié)晶等方法進(jìn)一步純化精制，干燥后制得蟲草素含量達(dá)90%以上的提取物產(chǎn)品。
[0011]采用本發(fā)明生產(chǎn)出的不同純度的蟲草素產(chǎn)品，可用于醫(yī)藥工業(yè)或功能食品的工業(yè)化生產(chǎn)，尤其適合蟲草生產(chǎn)廠家延長產(chǎn)業(yè)鏈，提高資源利用率，增加產(chǎn)品附加值。
【附圖說明】
[0012]圖1為實(shí)施例1大米培養(yǎng)殘基提取原液的HPLC圖譜，圖譜中3.70 min出峰的化合物為蟲草素。
[0013]圖2為實(shí)施例1經(jīng)混合樹脂分離純化后洗脫液的HPLC圖譜，其中3.22 min出峰的化合物為腺苷(結(jié)構(gòu)與蟲草素相近)，3.65 min出峰的為蟲草素。
[0014]圖3為蟲草素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紫外吸收光譜圖(光電二極管陣列檢測器在200-400 nm范圍掃描得到)，圖中顯不蟲草素最大吸收波長為208 nm和259 nm,由于208 nm處于紫外末端區(qū)域且溶劑本底干擾大，故選擇259 nm檢測蟲草素含量。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和優(yōu)選的實(shí)施案例對本發(fā)明進(jìn)一步闡述，其目的在于更好地理解本
【發(fā)明內(nèi)容】
，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]實(shí)施例1
1.脫脂:向干燥粉碎過篩后的蛹蟲草大米培養(yǎng)基中加入15倍量的石油醚，50 °C下振蕩脫脂2 h，回收固體干燥后備用。
[0017]2.提取:向脫脂處理后的培養(yǎng)基中加入25倍體積的水，水熱回流提取2 h，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，棄去固體濾渣。
[0018]3.醇沉:提取液中加入乙醇進(jìn)行醇沉，除去多糖，減壓回收乙醇后以水稀釋定容，制成粗提取液。
[0019]4.混合樹脂純化:將預(yù)先篩選出的兩種大孔吸附樹脂WYU-005和WYU-006進(jìn)行預(yù)處理，然后按樹脂干重1:1的比例進(jìn)行全混合，混合均勻的樹脂以濕法裝入內(nèi)徑10 mm的玻璃層析柱中，以5 BV/h流速吸附第(2)步的提取液，吸附完成后加入25%乙醇水溶液洗脫，洗脫流速2 BV/h,以HPLC檢測吸附殘液