t; 14表示加入的基因組DNA模板有PCR抑制物或濃度不足，需要重新提取基因組DNA或 增加DNA用量后重復(fù)實驗；內(nèi)參擴增曲線的Ct< 10,提示加入的樣品DNA過量，建議稀釋 DNA后重新進行實驗；
[0062] 空白對照反應(yīng)體系的作用：空白對照反應(yīng)體系中的FAM信號應(yīng)不出現(xiàn)"S"擴增曲 線或Ct多24,若FAM信號的Ct< 24,則此實驗結(jié)果視為無效，同時建議重復(fù)試驗；
[0063] 弱陽性反應(yīng)體系的作用：弱陽性反應(yīng)用于指示PCR反應(yīng)體系是否有效及反應(yīng)程序 是否正確設(shè)置。弱陽性對照中，R0X擴增曲線應(yīng)1〇<Ct< 14,FAM擴增曲線應(yīng)16 <Ct< 19。 如果R0X和FAM擴增曲線不在此范圍，則提示實驗出現(xiàn)問題，建議檢查試劑是否在有效期或 PCR反應(yīng)程序是否正確設(shè)置。
[0064] 靈敏度分析：取定量后濃度為10ng/ μ L的R132H 1%突變樣本基因組DNA進行稀 釋，使其濃度分別為l〇ng/ μL、5ng/ μL、2ng/ μL、lng/ μL、0. 5ng/ μL，按實施例1中的檢 測方法進行檢測，每個R132H反應(yīng)體系設(shè)置5個平行，結(jié)果表明，本發(fā)明靈敏度可以檢測到 2ng/yL的R132H 1%突變樣本。
[0065] 實施例2熒光PCR方法對比Sanger的方法學(xué)驗證
[0066] 按照實施例1中的方法進行熒光定量PCR檢測和數(shù)據(jù)分析，并同時開展Sanger驗 證，驗證數(shù)據(jù)與結(jié)果如下：采用與Sanger方法學(xué)對比研究的方式評估本發(fā)明中人類IDH1基 因突變檢測試劑盒的方法，計劃采用盲法對腦膠質(zhì)瘤患者石蠟組織樣本平行開展qPCR與 Sanger方法學(xué)對比，得到qPCR與Sanger方法符合率的驗證結(jié)果。
[0067]從目前已獲得的375例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床樣本研究結(jié)果顯示，共獲得370例有 效檢測數(shù)據(jù)，與Sanger檢測方法學(xué)對比驗證結(jié)果顯示，qPCR檢測與Sanger驗證一致率為 100%〇
[0068] 用于盲法對比的樣本來源于腦膠質(zhì)瘤樣本，包括：間變性少突膠質(zhì)瘤、星形細胞 瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、少突細胞瘤、部分腦膠質(zhì)瘤前體組織和垂體瘤組織樣本。
[0069] 驗證分析結(jié)果 [0070]R132H位點統(tǒng)計數(shù)據(jù)
[0071]
[0073] 備注：PPA:陽性符合率；NPA:陰性符合率；0ΡΑ:總體符合率
[0074] 從上表可知，在總共370例有效對比數(shù)據(jù)中，qPCR方法與Sanger方法相比，陽性 符合率為100%，陰性符合率為100%，總體符合率為100%。
[0075] 以上公開的僅為本發(fā)明的具體實施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測人IDHl基因突變的試劑盒，其特征在于，包括IDHl R132H PCR反應(yīng)混合 液，其中所述IDHl Rl32H PCR反應(yīng)混合液中包括溶解在PCR預(yù)混液中的以下組分：具有如 序列表中SEQ ID No. 1所示序列的IDHl R132H上游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 2所 示序列的IDHl R132H下游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 3所示序列的IDH1R132H探針、 具有如序列表中SEQ ID No. 4所示序列的內(nèi)參上游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 5所 示序列的內(nèi)參下游引物和具有如序列表中SEQ ID No. 6所示序列的內(nèi)參探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人IDHl基因突變的試劑盒，其特征在于，所述IDH1R132H PCR反應(yīng)混合液中各組分在PCR預(yù)混液中的濃度為：所述IDHl R132H上游引物的濃度 為2-4 y M，優(yōu)選3 y M ;所述IDHl Rl32H下游引物的濃度為2-4 y M，優(yōu)選3 y M ;所述IDHl R132H探針的濃度為2-4yM，優(yōu)選3yM ;所述內(nèi)參上游引物的濃度為l-3yM，優(yōu)選2yM ;所 述內(nèi)參下游引物的濃度為1-3 yM，優(yōu)選2 yM ;所述內(nèi)參探針的濃度為1-3 yM，優(yōu)選2 yM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測人IDHl基因突變的試劑盒，其特征在于，所述 IDH1R132H PCR反應(yīng)混合液的PCR預(yù)混液中還溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述 dUTP在PCR預(yù)混液中的濃度為0. 05-0. 8 y M，優(yōu)選0. 2 y M，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR 預(yù)混液中的濃度為0. 005-0. 02U/ y 1，優(yōu)選0.0 lU/ y 1。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的檢測人IDHl基因突變的試劑盒，其特征在于，還包括 弱陽性對照液和/或空白對照液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測人IDHl基因突變的試劑盒，其特征在于，所述弱陽性對 照液為IDHl R132H突變率為10%的人類基因組DNA，或者是按照如下方法制備的弱陽性對 照液：含有IDHl R132H突變的陽性質(zhì)粒溶解在沒有IDHl R132H突變的人類基因組DNA水 溶液中，使得陽性質(zhì)粒與沒有IDHl Rl32H突變的人類基因組DNA的拷貝數(shù)為1:9，所述陽性 質(zhì)粒與沒有IDHl R132H突變的人類基因組DNA在弱陽性對照液中的核酸總濃度為2-10ng/ y 1，優(yōu)選為l〇ng/ y 1 ;所述空白對照液是TE緩沖液。6. -種檢測人IDHl基因突變的實時熒光定量PCR Taqman探針法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 在IDHl R132H PCR反應(yīng)混合液中加入從樣品中提取的、作為模板的人類基因組 DNA，形成R132H反應(yīng)體系并進行熒光定量PCR擴增，其中： 所述IDHl R132H PCR反應(yīng)混合液中包括溶解在PCR預(yù)混液中的以下組分：具有如序列 表中SEQ ID No. 1所示序列的IDHl Rl32H上游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 2所示序 列的IDHl R132H下游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 3所示序列的IDHl R132H探針、具 有如序列表中SEQ ID No. 4所示序列的內(nèi)參上游引物、具有如序列表中SEQ ID No. 5所示 序列的內(nèi)參下游引物和具有如序列表中SEQ ID No. 6所示序列的內(nèi)參探針； (2) 結(jié)果判斷：根據(jù)人類基因組DNA在R132H反應(yīng)體系進行熒光定量PCR擴增時的突 變Ct值進行分析。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測人IDHl基因突變的實時熒光定量PCR Taqman探針 法，其特征在于，所述R132H反應(yīng)體系為：在16-20 y I IDHl R132H PCR反應(yīng)混合液中加入 1-4 y 1、濃度為2-10ng/ y 1的人類基因組DNA，優(yōu)選在18 y I IDHl R132H PCR反應(yīng)混合液 中加入2 y 1、濃度為IOng/ y 1的人類基因組DNA ;所述IDHl R132H PCR反應(yīng)混合液中各組 分在PCR預(yù)混液中的濃度為：所述IDHl R132H上游引物的濃度為2-4 y M，優(yōu)選3 y M ;所述 IDHl R132H下游引物的濃度為2-4 y M，優(yōu)選3 y M ;所述IDHl R132H探針的濃度為2-4 y M， 優(yōu)選3 yM ;所述內(nèi)參上游引物的濃度為1-3 yM，優(yōu)選2 yM ;所述內(nèi)參下游引物的濃度為 1-3 yM，優(yōu)選2 yM ;所述內(nèi)參探針的濃度為1-3 yM，優(yōu)選2 yM。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的檢測人IDHl基因突變的實時熒光定量PCR Taqman探針 法，其特征在于， PCR 的擴增過程為：37°C 3min ;95°C 3min ;95°C 15s，65°C 45s，14 個循環(huán)；95°C 15s， 60°C 45s，24個循環(huán)，在60°C 45s階段收集熒光； 所述結(jié)果判斷步驟中Ct值進行分析為： 當R132H反應(yīng)體系中的內(nèi)參ROX信號呈現(xiàn)"S"曲線、內(nèi)參擴增曲線10彡Ct彡14時， 可以判斷待測樣本R132H突變的陰性和陽性：當R132H反應(yīng)體系中的A Ct彡9時為R132H 突變陽性；當R132H反應(yīng)體系中ACt>9時為R132H突變陰性，其中ACt =待測樣品擴增曲 線的Ct值-內(nèi)參擴增曲線的Ct值。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8之一所述的檢測人IDHl基因突變的實時熒光定量PCR Taqman探 針法，其特征在于，所述IDHl Rl32H PCR反應(yīng)混合液的PCR預(yù)混液中還溶解有dUTP和尿嘧 啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR預(yù)混液中的濃度為0. 05-0. 8 y M，優(yōu)選0. 2 y M，所述尿嘧 啶DNA糖基化酶在PCR預(yù)混液中的濃度為0. 005-0. 02U/ y 1，優(yōu)選0.0 lU/ y 1。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9之一所述的檢測人IDHl基因突變的實時熒光定量PCR Taqman 探針法，其特征在于，還使用了弱陽性對照液和/或空白對照液，所述弱陽性對照液為 IDH1R132H突變率為10%的人類基因組DNA，或者是按照如下方法制備的弱陽性對照液：含 有IDHl R132H突變的陽性質(zhì)粒溶解在沒有IDHl R132H突變的人類基因組DNA水溶液中， 使得陽性質(zhì)粒與沒有IDHl R132H突變的人類基因組DNA的拷貝數(shù)為1:9,陽性質(zhì)粒與沒有 R132H突變的人類基因組DNA在弱陽性對照液中的核酸總濃度為2-10ng/ y 1，優(yōu)選為IOng/ y 1 ;所述空白對照液是TE緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人IDH1基因突變的探針法及其試劑盒。該方法包括以下步驟：(1)在IDH1？R132H？PCR反應(yīng)混合液中加入人基因組DNA，形成R132H反應(yīng)體系并進行熒光定量PCR擴增，其中IDH1？R132H？PCR反應(yīng)混合液中包括溶解在PCR預(yù)混液中的：IDH1？R132H上游引物、IDH1？R132H下游引物、IDH1？R132H探針、內(nèi)參上游引物、內(nèi)參下游引物和內(nèi)參探針；(2)結(jié)果判斷：根據(jù)PCR擴增的突變Ct值進行分析。該試劑盒包括：IDH1？R132H？PCR反應(yīng)混合液。該探針法和試劑盒為臨床上提供了一種速度快、靈敏度高、特異性強的IDH1基因突變檢測體系。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105238871
【申請?zhí)枴緾N201510781712
【發(fā)明人】閻海, 焦雨辰, 王曉月, 王思振, 熊梓鍇
【申請人】北京泛生子基因科技有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月13日