標(biāo)墊）上。
[0089] c.裝配：將吸水紙、NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊等裝配到一起（如圖5和7所示），切割 成3. 5~4mm寬的試條。
[0090] d.篩選：檢測(cè)純化的駝乳IgG3樣品或者駝乳樣品，用牛乳樣品作為陰性對(duì)照，陰 性結(jié)果檢測(cè)線有顯色，陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)線沒(méi)有顯色或者有很淺的顯色（如圖5)。篩選出有明 顯陰陽(yáng)性反應(yīng)的抗駝乳IgG3單克隆抗體，如表2。其中，編號(hào)為H2H6的單克隆抗體即為本 發(fā)明的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11099的小鼠骨髓瘤細(xì)胞H2H6分泌的單克隆抗體。
[0091 ] 表2抗駝乳IgG#抗競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)
[0092]
[0093] 采用競(jìng)爭(zhēng)法，樣品中的駝乳或駝乳中的IgG3與固定在硝酸纖維素膜上的抗駝乳 IgG3單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)膠體金標(biāo)記的抗體。當(dāng)樣品墊滴入樣品后，樣品沿著試紙通過(guò)毛細(xì)作 用泳動(dòng)，溶解金標(biāo)墊上干燥的膠體金標(biāo)記的抗盤乳]^6 3的抗體。
[0094] 若待測(cè)樣品中不存在駝乳或駝乳IgG3,則膠體金標(biāo)記的抗駝乳IgG3的抗體會(huì)泳動(dòng) 到檢測(cè)線和硝酸纖維膜上的抗駝乳IgG3單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而膠體金顆粒發(fā)生聚 集，在檢測(cè)線處形成紅色線條（陰性反應(yīng)）。
[0095] 若待測(cè)樣品中存在駝乳或駝乳IgG3,則膠體金標(biāo)記的抗駝乳^心單克隆抗體會(huì)和 樣品中的駝乳或駝乳IgG3&生免疫反應(yīng)而不會(huì)向前移動(dòng)，因此沒(méi)有或只有較少膠體金標(biāo)記 的抗駝乳IgG3單克隆抗體與硝酸纖維膜上包被的抗駝乳IgG3單克隆抗體結(jié)合，因此檢測(cè) 線不顯色或顯色較淺（陽(yáng)性或弱陽(yáng)性反應(yīng)）。
[0096] ③競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)駝乳與牛乳的混合樣品
[0097] a.混合樣品：將駝乳與牛乳按照體積比1:9、3:7、5:5、7 :3、9:1分別混合，得到混 合樣品。
[0098] b.檢測(cè)：將混合樣品分別離心2000rpm2分鐘，吸取10~15μL中層的乳清進(jìn)行 檢測(cè)。
[0099] c.檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，檢測(cè)樣品中的駝乳含量為lyg即可檢測(cè)到 陽(yáng)性反應(yīng)。
[0100] ⑵夾心法
[0101] ①篩選方法：
[0102] a.包被：將純化好的抗駝乳IgG^單克隆抗體用10mMpH7. 4PBS緩沖液稀釋到 1. 0~2.Omg/mL，包被到NC膜上，烘干。
[0103] b.標(biāo)記：用pH8. 0的膠體金標(biāo)記抗§它乳IgG3單克隆抗體，加入lvol%BSA作為穩(wěn) 定劑，lOOOOrpm離心4°C30分鐘，沉淀用含蔗糖和BSA的復(fù)溶液分散，固化在玻璃纖維墊 上。
[0104] c.配對(duì)：將不同的抗駝乳IgG3單克隆抗體分別包被、標(biāo)記，并且兩兩配對(duì)。
[0105] d.篩選：檢測(cè)純化的駝乳IgG3抗體或者駝乳樣品，用牛乳IgG或牛乳樣品作為陰 性對(duì)照，陰性結(jié)果檢測(cè)線沒(méi)顯色，陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)線有顯色。篩選出有明顯陰陽(yáng)性反應(yīng)的抗駝 乳1@6 3單克隆抗體對(duì)。
[0106] ②篩選結(jié)果：
[0107] 當(dāng)使用純化的駝乳IgG3抗體為檢測(cè)樣品時(shí)，找到了兩對(duì)檢測(cè)駝乳IgG3的單克隆抗 體對(duì)，如表3 ;當(dāng)使用駝乳為檢測(cè)樣品時(shí)，盡管這兩個(gè)單抗的配對(duì)有反應(yīng)，但與駝乳IgGjA體作為樣品的檢測(cè)結(jié)果相比，反應(yīng)比較弱，顯色也比較慢（表現(xiàn)為弱陽(yáng)性）?？梢?，采用夾心 法制備的檢測(cè)試紙對(duì)于以駝乳或駝乳混合物為檢測(cè)樣品時(shí)，靈敏度和有效性均不如采用 競(jìng)爭(zhēng)法原理制備的檢測(cè)試紙。
[0108] 產(chǎn)生這種情況的原因可能是：
[0109] a.由于駝乳中的酪蛋白、脂肪等大分子或其他成分對(duì)硝酸纖維素膜產(chǎn)生了封閉作 用，減弱了反應(yīng)的強(qiáng)度；
[0110]b.使用純化的IgG3抗體為檢測(cè)樣品，由于濃度和純度均較高，有效反應(yīng)量約 5μg，而駝乳樣品中的IgG3抗體濃度較低，有效反應(yīng)量約1μg。
[0111] 表3夾心法單抗配對(duì)結(jié)果
[0112]
[0113] 將競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法的篩選結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，夾心法的篩選結(jié)果顯示，當(dāng)使用駝乳 IgG3抗體為檢測(cè)樣品找到兩對(duì)檢測(cè)駝乳IgG3的單克隆抗體對(duì)，而使用駝乳為檢測(cè)樣品時(shí)， 這兩個(gè)單抗的配對(duì)還是有反應(yīng)的，但是相比駝乳以心抗體作為樣品的檢測(cè)結(jié)果，反應(yīng)比較 弱，顯色也比較慢。與之相比，競(jìng)爭(zhēng)法的結(jié)果較好。因此，本發(fā)明最終選擇競(jìng)爭(zhēng)法制作駝乳 以6 3金標(biāo)檢測(cè)試紙。
[0114] 5.駝乳IgG3金標(biāo)檢測(cè)試紙
[0115] 試紙結(jié)構(gòu)如圖7所示。
[0116] (1)樣本要求：
[0117] ①使用乳液的乳清作為檢測(cè)樣本。將乳液樣品于3000rpm離心10分鐘，去掉上層 的脂肪和下層的沉淀，中層的液體為乳清。
[0118] ②檢測(cè)時(shí)盡量使用新鮮的樣本，如樣本不能及時(shí)測(cè)定，可置2°C~8°C-周內(nèi)進(jìn)行 檢測(cè)，長(zhǎng)期保存需在_20°C冷凍，忌反復(fù)凍融。
[0119] ③凍存樣本解凍后應(yīng)充分混勻，檢測(cè)前樣本必須恢復(fù)至室溫。
[0120] (2)檢測(cè)方法：
[0121] ①檢測(cè)試紙條、待檢樣品和其他檢測(cè)用材料等測(cè)試前需平衡至室溫并編號(hào)。
[0122] ②打開試條包裝筒，取出試條，在樣品墊區(qū)域上滴加待測(cè)樣品20μL乳清，如圖 8-1所示。
[0123] ③待樣品吸收后，再逐滴滴加1~2滴樣品稀釋液于稀釋液墊上，如圖8-2所示。
[0124] ④計(jì)時(shí)15分鐘讀取檢測(cè)結(jié)果，超過(guò)15分鐘檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
[0125] (3)檢測(cè)結(jié)果的解釋
[0126] ①檢測(cè)線沒(méi)有顯色，表明檢測(cè)樣品為駝乳，如圖9-1所示。
[0127] ②檢測(cè)線顯色，表明檢測(cè)樣品不是駝乳純品，可能為摻水或摻其他乳的混合物，如 圖9-2所示。
[0128] ③通過(guò)觀察檢測(cè)線的深度判斷駝乳含量，顏色越深表明駝乳含量越少，如圖9-3 所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株分泌抗駝乳IgG 3單克隆抗體IgG的小鼠骨髓瘤細(xì)胞H2H6,所述細(xì)胞株于2015 年8月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.11099。2. 抗駝乳IgG3單克隆抗體IgG，所述單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述的小鼠骨髓瘤細(xì) 胞產(chǎn)生的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗駝乳IgG 3單克隆抗體IgG，其特征在于所述單克隆抗體為 IgG2b亞類，其價(jià)效達(dá)1:102400。4. 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測(cè)駝乳制品中駝乳含量水平的應(yīng)用。5. 含有駝乳重鏈IgGJA體的檢測(cè)試紙，所述試紙包括樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素 膜和吸收墊，其特征在于所述硝酸纖維素膜包被如權(quán)利要求2所述的抗駝乳^心單克隆抗 體的抗體IgG。6. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試紙，其特征在于所述抗駝乳IgG 3單克隆抗體的抗體由膠 體金標(biāo)記，固化在金標(biāo)結(jié)合墊上。7. 如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試紙，其特征在于所述檢測(cè)試紙采用競(jìng)爭(zhēng)法制備得到。
【專利摘要】本發(fā)明提供一株小鼠骨髓瘤細(xì)胞H2H6以及由該細(xì)胞產(chǎn)生的抗駝乳IgG3單克隆抗體IgG，其價(jià)效達(dá)1:102400。本發(fā)明還提供含有駝乳重鏈IgG3抗體的檢測(cè)試紙，所述試紙包括樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，其中，抗駝乳IgG3的單克隆抗體由膠體金標(biāo)記，所述檢測(cè)試紙采用競(jìng)爭(zhēng)法制備得到。本發(fā)明利用駝乳特異性重鏈抗體作為免疫原制備單克隆抗體，并制作檢測(cè)試劑盒/檢測(cè)試紙；通過(guò)對(duì)比競(jìng)爭(zhēng)法與夾心法，本發(fā)明的檢測(cè)試紙檢測(cè)效果好，具有特異性與靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)；可用于駝乳及其制品中乳源摻假的快速檢測(cè)。CGMCC No. 1109920150813
【IPC分類】C12R1/91, G01N33/577, C07K16/18, C12N5/20, G01N33/558
【公開號(hào)】CN105238759
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510663023
【發(fā)明人】吉日木圖, 伊麗, 斯日古楞, 李闊海, 葉俊, 景鈺湘
【申請(qǐng)人】吉日木圖, 伊麗, 斯日古楞, 李闊海, 葉俊, 景鈺湘
【公開日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日