Cl 中和所收集的樣品；
[0035] ⑤純化的IgG3樣品用10mMpH7. 4PBS透析，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] (3)純化駝乳IgG3進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)果可見分子量43kDa左右IgG3的 重鏈抗體，如圖2所示。
[0037] 2.小鼠抗駝乳IgG#克隆抗體免疫
[0038] 通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的線路流程如圖3所示。
[0039] ⑴小鼠免疫：
[0040] ①第一天，取抗原（純化的盤乳IgG3)用生理鹽水稀釋至0· 2mg/ml，取750μ1經(jīng) 過稀釋的抗原溶液與750μ1弗氏完全佐劑混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；
[0041] ②第三^ 天，抗原用生理鹽水稀釋至0. 2mg/ml，取750μ1抗原與750μ1福氏不 完全佐劑混合，乳化，腹腔注射3只小鼠；
[0042] ③第四十五天，抗原用生理鹽水稀釋至0.lmg/ml，取1500μ1抗原直接腹腔注射3 只小鼠；
[0043] ④第五十九天，取50yg抗原尾靜脈注射1只小鼠，三天后進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0044] (2)ELISA：
[0045] ①包被：將抗原用pH9. 6的碳酸緩沖液稀釋為5μg/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔 100μ1，4Γ過夜；
[0046]②封閉：將包被液棄去，每孔加入100μ1封閉液（5wt%脫脂奶粉），22°C放置lh;
[0047] ③加入樣本：棄去封閉液，加入樣品，每孔100μ1加入酶標(biāo)板，37°C放置lh;
[0048] ④洗滌：用PBS-T洗3次，每次間隔5分鐘，拍干；
[0049] ⑤加入二抗：酶標(biāo)羊抗鼠，稀釋至工作濃度，每孔100μ1加入酶標(biāo)板，37°C放置1 小時(shí)；
[0050] ⑥洗滌：用PBS-T洗3次，每次間隔5分鐘，拍干；
[0051] ⑦加入TMB顯色底物：每孔100μ1加入酶標(biāo)板，37°C放置5min;
[0052] ⑧加入終止液：每孔加入2MH2S04100μ1 ;
[0053] ⑨讀數(shù)：酶標(biāo)儀0D450nm讀數(shù)。
[0054] (3)細(xì)胞融合：
[0055] ①SP2/0的收集：選擇生長狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞（保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期，融 合前兩天換液），用彎頭吸管將細(xì)胞吹下，收集于50ml離心管中，1200rpm離心5min。棄去 上清，用20mlRPMI1640培養(yǎng)基（購買自美國Gibco公司）將細(xì)胞重懸。
[0056] ②脾細(xì)胞的收集：小鼠摘眼球取血（37°C放置1小時(shí)后8000rpm離心lOmin，吸出 上清即為血清，可作為陽性對照，分裝凍存于-20°C)，頸椎脫白處死，放入75vol%乙醇中 消毒5min。小鼠轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)中，左側(cè)向上，將皮膚剪一小口，從開口處拉開皮膚暴露腹膜，用 無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出脾臟放入篩網(wǎng)中研磨脾臟，用15mlRPMI1640培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)收 集脾細(xì)胞，1200rpm離心5min，棄去上清，用10mlRPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸。
[0057] ③細(xì)胞融合：將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞混勻，1200rpm離心5min，棄去上清，將細(xì)胞彈 松，吸lml預(yù)熱的融合劑（PEG1000)，在lmin內(nèi)逐滴加入，再放置37°C水浴中反應(yīng)lmin，然 后加入終止液（在2分min內(nèi)加入15mlRPMI1640培養(yǎng)基，并輕輕攪拌細(xì)胞），1200rpm離 心5min，棄去上清，加入25ml預(yù)熱的HAT培養(yǎng)基（購買自美國Gibco公司），將細(xì)胞重懸，輕 輕混勻（用吸管從底部吸起細(xì)胞，在液面頂部輕輕盤旋滴入），用吸管將細(xì)胞懸浮液加入預(yù) 先接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔1滴，鋪2或3塊板，置孵箱中培養(yǎng)（37°C，5vol%C02)。
[0058] ④融合板的檢測：
[0059] a.融合后第3天觀察96孔板，看融合細(xì)胞的生長狀況、有無污染，保證細(xì)胞正常生 長。
[0060] b.融合后第三天和第七天換液兩次，用吸管將融合板中的培養(yǎng)上清吸光，棄去，然 后每孔補(bǔ)加5滴新鮮的HAT培養(yǎng)基，置孵箱中培養(yǎng)（37°C，5vol%C02)。
[0061] c.第二次換液后2到4天進(jìn)行抗體檢測，將孔板中的上清每孔吸出100μ1加入 包被好的96孔酶標(biāo)板，并作相應(yīng)的編號(hào)，ELISA檢測上清中是否有特異性抗體。
[0062] d.選擇ELISA結(jié)果為陽性的孔，對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞進(jìn)行第一次克隆，將細(xì) 胞吸出計(jì)數(shù)、稀釋，以理論值每滴一個(gè)細(xì)胞加入預(yù)先接種飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，置孵箱中 培養(yǎng)（37°C，5vol%C02) 〇
[0063] e.克隆4天后，用顯微鏡觀察，并對有克隆細(xì)胞的孔進(jìn)行標(biāo)記，第七天換液一次， 換液后4到6天（觀察細(xì)胞生長情況而定），進(jìn)行抗體檢測，將孔板中的上清每孔吸出 100μ1加入包被好的96孔酶標(biāo)板，并作相應(yīng)的編號(hào)，ELISA檢測上清中是否有特異性抗體。
[0064] f.選擇ELISA結(jié)果為陽性的孔，對應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞進(jìn)行克隆，方法與第一 次相同，分別進(jìn)行三次克隆。
[0065] g.用彎頭吸管將細(xì)胞吹打制成懸液，1000轉(zhuǎn)離心lOmin。棄去上清，用凍存液將細(xì) 胞重懸，分裝入凍存管中，管壁作好標(biāo)記。將細(xì)胞放入程序4°C冰箱中l(wèi)h，轉(zhuǎn)入液氮罐口懸 掛30min，放入液氮凍存。
[0066] ⑷單抗生產(chǎn)
[0067] ①將移去細(xì)胞混懸液的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)加入RPMI1640完全培養(yǎng)基，置孵箱中培養(yǎng) (37〇C,5vol%C02) 〇
[0068] ②待細(xì)胞基本布滿瓶底，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)收集細(xì)胞。將細(xì)胞用彎頭吸管吹打制成 懸液，1000轉(zhuǎn)離心lOmin，棄去上清，用生理鹽水將細(xì)胞重懸，腹腔注射入鼠體內(nèi)，每只小鼠 注射0. 5ml。
[0069] ③腹水的收集和保存：
[0070] a.小鼠接種雜交瘤細(xì)胞后需注意每天觀察小鼠狀態(tài)；
[0071] b.在小鼠瀕死前頸椎脫白處死，用手術(shù)剪剪開皮膚，撕開皮膚暴露腹膜，再在腹膜 上剪一小口，用滴管將腹水吸出；
[0072] c.腹水3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清，分裝凍存于_70°C，并取少量ELISA檢測 腹水效價(jià)。單抗亞類以及效價(jià)見表1 ;
[0073] 表1單克隆抗體腹水亞類及效價(jià)
[0074]
[0076] 3.抗駝乳IgG3單克隆抗體的純化
[0077] (1)純化方法
[0078] ①樣品處理：取抗駝乳IgG3單克隆抗體小鼠腹水，按體積比1 :1加入0. 02MpH7. 0 磷酸鹽緩沖液，高速低溫離心機(jī)l〇〇〇〇rpm離心4°C10分鐘，去掉脂肪和沉淀；
[0079] ②預(yù)處理ProteinGaogaroseFF柱，用 10mLProteinGaogaroseFF膠裝柱， 用0. 02MpH7. 0的磷酸鹽平衡緩沖液平衡至少5倍體積；
[0080] ③按其操作步驟上樣，用至少10倍體積的平衡緩沖液清洗柱子，去除雜質(zhì)；
[0081] ④用0· 1MρΗ2· 7的甘氨酸緩沖液洗脫，收集IgG洗脫峰，并用1MpH9.OTris-HCl 中和所收集的樣品；
[0082] ⑤純化的IgG樣品用10mMpH7. 4PBS透析，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0083] (2)純化的抗駝乳IgG3單克隆抗體IgG進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4。
[0084] 4.采用金標(biāo)免疫層析法進(jìn)行抗駝乳IgG3的單克隆抗體的篩選
[0085] (1)競爭法：
[0086] ①篩選方法：
[0087] a.包被：將純化好的抗駝乳IgG^單克隆抗體用10mMpH7. 4PBS緩沖液稀釋到 0. 3~0. 5mg/mL，包被到硝酸纖維素（NC)膜上，烘干。
[0088] b.標(biāo)記：用pH8. 0的膠體金標(biāo)記盤乳IgG3抗體，加入lvol%BSA作為穩(wěn)定劑， lOOOOrpm離心4°C30分鐘，沉淀用含重量體積比0. 1 %蔗糖和1 %BSA的復(fù)溶液分散，烘干 固化在玻璃纖維墊（金