海洋鏈霉菌環(huán)二肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及環(huán)二膚，尤其是設(shè)及海洋鏈霉菌環(huán)二膚及其制備方法。
【背景技術(shù)】 W02] 環(huán)二膚，又稱為2, 5-二酬贓嗦，2, 5-二氧贓嗦，或二膚酸酢，由兩個(gè)氨基酸 通過膚鍵環(huán)形成，其典型結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)二酬贓嗦。環(huán)二膚具有特別穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié) 構(gòu)和構(gòu)象約束作用，運(yùn)一結(jié)構(gòu)在藥物化學(xué)研究中是一類重要的藥效團(tuán)（[l]Mcdowell RS,GadekTR.StructuralstudiesofpotentconstrainedRGDpeptides[J].JAm 化emSoc，1992, 114(24) :9245 ;[2]趙喜梅.環(huán)二膚與一價(jià)金屬離子的相互作用識(shí)別研 究巧].鄭州：鄭州大學(xué)，2010:85.)。環(huán)二膚來源很廣，有些是動(dòng)植物中生來就有的， 有些是通過發(fā)酵或者在食品加工過程中產(chǎn)生的。環(huán)二膚被發(fā)現(xiàn)普遍存在于蛋白及多膚 水解物，W及動(dòng)植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物中。由于來源不同，環(huán)二膚的生物 活性也不同，目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)二膚因其較強(qiáng)的生物活性而被人們廣泛關(guān)注，例如，環(huán)二膚具 有影響胞間信息傳遞、抑制毒素、促進(jìn)癌細(xì)胞調(diào)亡、鎮(zhèn)痛、抑制致病微生物等作用（[3]強(qiáng) 薇，梅剛.真菌中環(huán)二膚及其衍生物的抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].長沙：中南大學(xué)藥學(xué) 院，2014. 25(21) :2007-2009 ; [4]盧犧元，徐德昌.環(huán)二膚生物活性的研究進(jìn)展[J].生物 信息學(xué)，2011，9(4) : 289-291.)。
[0003] 由于海洋環(huán)境存在低溫、高壓、寡營養(yǎng)、高鹽等特點(diǎn)，使海洋微生物可能產(chǎn)生出結(jié) 構(gòu)新穎多樣、活性獨(dú)特的天然產(chǎn)物，因此引起了許多科學(xué)家的關(guān)注。目前已經(jīng)從海洋細(xì)菌、 海洋放線菌、海洋真菌、紅樹林葉內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中已分離出大量的具有生物活性的 環(huán)二膚類化合物。
[0004] 目前國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)大多通過有機(jī)溶劑萃取、凝膠柱層析、一系列正相和反相色 譜柱和高效液相色譜等現(xiàn)代分離技術(shù)來分離環(huán)二膚類化合物（[引宮俊，湯華，耿婉麗， 劉寶妹，孫鵬，李玲，李志勇，張文.仿刺參共附生放線菌化evibacteriumsp.中的環(huán) 二膚成分的分離和鑒定[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012, 33 (12) : 1284-1287)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供兩種海洋鏈霉菌環(huán)二膚及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第=目的在于提供兩種海洋鏈霉菌環(huán)二膚的應(yīng)用。
[0008] 所述鏈霉菌（Streptomycessp. )HNS054已于2014年03月20日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué) 院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中屯、登記入冊編號(hào)：CGMCCNo. 8946。
[0009] 所述兩種海洋鏈霉菌環(huán)二膚分別是環(huán)（脯-酪）二膚和環(huán)（脯-鄉(xiāng)）二膚。
[0010] 所述兩種海洋鏈霉菌環(huán)二膚的制備方法如下：
[0011] 1)獲得膚類粗提物，具體方法為：
[0012] 先發(fā)酵海洋鏈霉菌，得海洋鏈霉菌發(fā)酵液，再通過連續(xù)流離屯、，錯(cuò)流過濾，5K濾膜 切向流過濾，得發(fā)酵液上清，發(fā)酵液上清經(jīng)大孔樹脂吸附和解吸附獲得膚類粗提物；將膚類 粗提物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后直接進(jìn)行純化，或再經(jīng)冷凍干燥W粉末狀態(tài)避光低溫長期保存；
[0013] 2)經(jīng)乙臘-水濃度梯度反相HPLC制備，獲得多個(gè)組分，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后直接 進(jìn)行純化，或再經(jīng)冷凍干燥W粉末狀態(tài)避光低溫長期保存；
[0014] 3)將各組分通過乙臘-水等度反相HPLC分離獲得純膚，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后 W粉末狀態(tài)避光低溫長期保存。
[0015] 在步驟1)中，所述發(fā)酵海洋鏈霉菌所用的培養(yǎng)基可為2216E培養(yǎng)基，2216E培養(yǎng)基 的配方為：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高鐵0.Olg，瓊脂：15~20g，抑：7. 4~7. 5,無菌海水 1000ml，高壓蒸汽滅菌：12rC，20min;發(fā)酵的條件為：28°C，165rmp，9化；
[0016] 所述切向流過濾可采用PA化Centramate超濾系統(tǒng)，先用MWC0300K膜包濾去大分 子，濾過液再用MWC05K膜包濾過小分子蛋白/膚類；需要注意的是膜包標(biāo)稱的濾過或截留 孔徑大小要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，標(biāo)稱10K的膜包在實(shí)際中會(huì)濾過部分10~20K的蛋白；
[0017] 所述大孔樹脂可采用型號(hào)為NKA-9的大孔樹脂，可采用鄭州勤實(shí)科技有限公司產(chǎn) 品；
[0018] 所述大孔樹脂吸附和解吸附的流程是：將處理好的大孔樹脂W1 : (3~20)體 積比與切向流濾過液混合，4°C下，通過搖床、磁力攬拌、機(jī)械攬拌等方式連續(xù)攬拌10~ 1地，之后用去離子水漂洗大孔樹脂5次W上，將大孔樹脂裝入層析柱用層析系統(tǒng)在280nm 或215nm波長檢測膚類洗脫過程，洗脫中逐步提高乙醇質(zhì)量百分濃度至75 %，最后用50mM 化OH洗脫，收集40 %~75 %乙醇洗脫組分。
[0019] 在步驟2)中，所述乙臘-水濃度梯度反相HPLC制備可采用C18反相柱Welch 叫timataXB-C18,內(nèi)徑30mm，高度250mm，填料粒徑10ym，孔徑辨:〇A，所用的流動(dòng)相按質(zhì) 量百分比含0. 1 % =氣乙酸；上樣樣品用起始乙臘濃度的含0. 1 % =氣乙酸的水溶液溶解。W20] 在步驟如中，所述乙臘-水等度反相HPLC分離可采用反相柱YMC-Pack 0DS-A250X10mm，填料粒徑5ym;每次上樣40ul，流速1.0血/min;16%乙臘等度洗脫；檢 測波長 280nm、210nm、254nm、230nm。
[0021] 所述環(huán)（脯-酪）二膚對(duì)乳腺癌、宮頸癌和結(jié)腸癌有抑制作用，同時(shí)還有免疫活 性、調(diào)節(jié)激素及調(diào)控能量代謝的作用；所述環(huán)（脯-鄉(xiāng)）二膚抗媛弧菌作用（MIC為0.05); 體外抗腫瘤活性（13. 3± 1. 6) %巧ug/ml);質(zhì)量濃度為50yg/ml時(shí)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長 抑制率約為53% ;對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率約為17%。
[0022] 本發(fā)明W鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054為菌種，經(jīng)過斜面培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、液 體發(fā)酵培養(yǎng)、分離和提純，最后獲得本發(fā)明的兩種環(huán)二膚。
[0023] 本發(fā)明提供一種大孔樹脂NKA-9吸附和解吸附與高效液相色譜法相結(jié)合的分離 環(huán)二膚的方法。本發(fā)明步驟簡潔，操作簡單，整個(gè)分離流程僅需9化便可獲得純環(huán)二膚；本 發(fā)明所用NKA-9大孔樹脂相較于傳統(tǒng)分離方法所用的凝膠、C18或C8等材料價(jià)格低廉。本 發(fā)明提供的分離環(huán)二膚方法能高效低能的分離出純環(huán)二膚，對(duì)環(huán)二膚類物質(zhì)的研究具有重 要意義。
[0024] 本發(fā)明所用菌株產(chǎn)次級(jí)代謝物周期短，所產(chǎn)代謝物活力高，是一株生產(chǎn)性能優(yōu)良 的菌種。本發(fā)明設(shè)及到的海洋鏈霉菌環(huán)二膚制備方法高效而廉價(jià)、處理通量高，易于放大。
【附圖說明】
[0025]圖1為實(shí)施例2大孔吸附樹脂NKA-9的洗脫曲線。
[00%] 圖2為實(shí)施例2第二級(jí)分離洗脫曲線。
[0027] 圖3為實(shí)施例3中化合物C-1-0的iH-NMR數(shù)據(jù)圖。 陽02引 圖4為實(shí)施例3中化合物C-1-0的"C-NMR數(shù)據(jù)圖。
[0029] 圖5為實(shí)施例3中化合物C-1-0的質(zhì)譜信息。
[0030] 圖6為實(shí)施例3中化合物C-1-0化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0031] 圖7為實(shí)施例3中化合物C-1-1的iH-NMR數(shù)據(jù)圖。
[0032] 圖8為實(shí)施例3中化合物C-1-1的"C-NMR數(shù)據(jù)圖。 陽03引圖9為實(shí)施例3中化合物C-1-1的質(zhì)譜信息。
[0034]圖10為實(shí)施例3中化合物C-1-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】 陽0對(duì)實(shí)施例1
[0036] 1、菌種：海洋鏈霉菌（Str巧tomycessp. )HNS054,保藏號(hào)為CGMCCNo. 8946。
[0037] 2、發(fā)酵及發(fā)酵條件：
[003引 （1)、平板培養(yǎng)基：酵母膏：4g，麥芽浸膏：10g，葡萄糖：4g，瓊脂：20g，無菌海水： 1L，抑：7. 3,高壓蒸汽滅菌：110°C，30min。
[0039] 平板培養(yǎng)條件：28°C培養(yǎng)5~7d。
[0040] (2)種子培養(yǎng)基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高鐵：0.01g，瓊脂：15~20g，無菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。
[0041] 培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為：165rmp，28°C震蕩培養(yǎng)3d，作為液體種子。
[0042] (3)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白腺：5g，酵母膏：lg，憐酸高鐵：0.Olg，瓊脂：15~20g，無菌 海水：1000ml，抑：7. 4 ~7. 5。 陽0創(chuàng)培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為165rmp，28°C震蕩發(fā)酵4d。 W44] 實(shí)施例2 W45] 1、斜面培養(yǎng)同實(shí)施例1 ;
[0046] 2、種子培養(yǎng)同實(shí)施例1;
[0047] 3、發(fā)酵培養(yǎng)同實(shí)施例1 ;
[0048] 4、海洋鏈霉菌環(huán)二膚的分離純化： W例 （1)、HNS054在化錐形瓶中發(fā)酵化X5瓶，連續(xù)流離心錯(cuò)流過濾，5K濾膜切向流 過濾得發(fā)酵液上清。
[0050] 似、在4°C層析柜中，約13LMWC05K膜包濾過液與500血NKA-9大孔吸附樹脂磁 力攬拌過夜（1化)，吸附后的大孔樹脂用500mL去離子水漂洗10次； 陽05U (3)、將樹脂裝入5. 5cmX50cm層析柱，純水3血/min繼續(xù)漂洗300ml，然后依次W 10%、25%、40%乙醇311117111111各 3001111，50%、60%乙醇311117111111各1001111，75%乙醇洗脫 300ml，50mMNaOH3mL/min洗脫30