因此，尋求解決使用流式細(xì)胞術(shù)檢測樣品中微生物存在與否的當(dāng)前方法中的缺點(diǎn) 的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明設(shè)及鑒定樣品中至少一種微生物存在與否的方法。如本文所述，首先獲得 用于測試至少一種微生物存在與否的生物或環(huán)境樣品，并且然后制備用于待進(jìn)行的測定。 制備的樣品與樹脂結(jié)合，其后從樣品移除樹脂。然后將制備的樣品與測定目標(biāo)的標(biāo)記結(jié)合， 其后分析樣品W確定測定目標(biāo)的存在與否。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，待分析的樣品獲得自是復(fù)合基質(zhì)或包含復(fù)合基質(zhì)的 生物或環(huán)境樣品。復(fù)合基質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在各種樣品中，包括但不限于食物產(chǎn)品、化妝品和±壤樣 品。在引入樹脂之前，對(duì)具體類型的生物或環(huán)境樣品，可W使用已知的技術(shù)制備待分析的樣 品，并且所述技術(shù)對(duì)技術(shù)人員是眾所周知的。
[0023] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，樹脂用于調(diào)節(jié)或減小復(fù)合基質(zhì)對(duì)下游樣品測定分 析的干擾。各種樹脂在本領(lǐng)域是已知的，并且具體一種或多種樹脂的選擇將取決于待分析 的生物或環(huán)境樣品的性質(zhì)。在進(jìn)行測定前可通過比如過濾的技術(shù)移除樹脂，但是采用的具 體技術(shù)主要是設(shè)計(jì)選擇的問題并取決于樹脂的類型和樣品制備。技術(shù)人員將基于運(yùn)些和其 它因素選擇合適的分離技術(shù)。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，在樹脂處理和移除樹脂后，使用流式細(xì)胞儀分析樣品。在移 除樹脂后和流式細(xì)胞術(shù)前，適當(dāng)?shù)娜玖媳热绾怂崛玖匣蚱渌晒馊玖吓c樣品結(jié)合。染料有 助于在流式細(xì)胞儀中檢測測定目標(biāo)。還可W采用增強(qiáng)技術(shù)比如巧滅W進(jìn)一步提高測定的完 整性。
【附圖說明】
[0025] 圖1圖解了本文描述的使用流式細(xì)胞術(shù)檢測生物樣品中的細(xì)菌的方法的一個(gè)實(shí) 施方式的步驟。
[00%]圖2呈現(xiàn)了在流式細(xì)胞術(shù)分析期間生成的一系列點(diǎn)陣圖，所述分析比較使用樹脂 處理的樣品與沒有使用樹脂處理的樣品的結(jié)果，W檢測生物樣品中大腸桿菌存在與否。
[0027] 圖3呈現(xiàn)了在流式細(xì)胞術(shù)分析期間生成的一系列點(diǎn)陣圖，所述分析比較使用樹脂 處理的樣品與沒有使用樹脂處理的樣品的結(jié)果，W檢測生物樣品中銅綠假單胞菌存在與 否。
[0028] 圖4呈現(xiàn)了在流式細(xì)胞術(shù)分析期間生成的一系列點(diǎn)陣圖，所述分析確定加入加料 碎牛肉中的細(xì)菌量，并且將該結(jié)果與從TVO測定獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 在許多微生物應(yīng)用中準(zhǔn)確確定活的、死的和全部細(xì)菌是重要的。對(duì)于基于培養(yǎng)的 方法論，需要將在固體生長培養(yǎng)基上形成菌落和在液體營養(yǎng)肉湯中增殖的活的微生物。運(yùn) 些傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的測試是耗時(shí)的，并且對(duì)生長緩慢或不可培養(yǎng)的活的微生物作用很差。 正因如此，運(yùn)些傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的測試不提供應(yīng)用中必需的實(shí)時(shí)結(jié)果或及時(shí)信息，所述應(yīng) 用比如食物和水的病原體存在的健康相關(guān)性監(jiān)測。
[0030] 本文公開的是通過對(duì)從復(fù)合基質(zhì)獲得的生物樣品運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)改進(jìn)已知的測 定比如TV0測定的方法。從復(fù)合基質(zhì)獲得或包含復(fù)合基質(zhì)的生物樣品，比如食物產(chǎn)品、化妝 品和±壤樣品，因?yàn)橛蓮?fù)合基質(zhì)的顆粒引起的干擾，使用流式細(xì)胞術(shù)可難W準(zhǔn)確地分析。更 具體而言，復(fù)合基質(zhì)使得它難W光學(xué)地檢測樣品中的目標(biāo)微生物，因?yàn)槠湟廊浑yW將目標(biāo) 微生物與其它樣品成分區(qū)別開。
[0031] 具體而言，本文所述的方法在使懷疑含有目標(biāo)微生物的樣品經(jīng)歷測試或測定W檢 測目標(biāo)微生物存在與否前，將樣品中的微生物與通常被描述為復(fù)合基質(zhì)（例如，碎牛肉、 蛋、牛奶、±壤、化妝品等）的其它樣品成分分離并提高樣品質(zhì)量。使用本文所述的方法的 優(yōu)勢包括但不限于：有助于檢測多種微生物菌株；移除與基質(zhì)相關(guān)聯(lián)的測定抑制劑；移除 干擾基質(zhì)微粒；增強(qiáng)讀取檢測信號(hào)的強(qiáng)度或能力并提供充分的樣品尺寸縮減W允許使用代 表性食物樣品尺寸和/或小培養(yǎng)基體積。
[0032] 本文所述的方法幫助W檢測低水平的病原體或散發(fā)性污染所必需的方式改進(jìn)樣 品制備，其可能減少或甚至消除為了加速微生物生長而在檢測前富集樣品培養(yǎng)物的需要。
[0033] 本文所述的方法通過從樣品移除與基質(zhì)相關(guān)聯(lián)的抑制劑，濃縮樣品中的目標(biāo)微生 物/病原體/細(xì)菌（如果存在），同時(shí)還增強(qiáng)從樣品獲得的指示目標(biāo)微生物/病原體/細(xì)菌 存在與否的可檢測的信號(hào)，所述抑制劑可W干擾目標(biāo)微生物/病原體/細(xì)菌的測定。方法是 有優(yōu)勢的，在于它還是通用的（例如，可應(yīng)用于多種類型的基質(zhì)和目標(biāo)微生物/病原體/細(xì) 菌），并且是簡單的，快速的和廉價(jià)的。此外，本文所述的方法減少因?yàn)槟繕?biāo)微生物/病原體 /細(xì)菌與殘留基質(zhì)組分的交叉反應(yīng)或因?yàn)闄z測到死的目標(biāo)細(xì)胞而可能出現(xiàn)的假陽性或陰性 結(jié)果的可能性。
[0034] 本文所述的方法將樹脂引入與復(fù)合基質(zhì)結(jié)合的樣品W調(diào)節(jié)或減小復(fù)合基質(zhì)對(duì)下 游樣品測定分析的干擾。樹脂或樹脂的組合吸附殘留基質(zhì)組分，并且從樣品分離樹脂轉(zhuǎn)而 從樣品移除復(fù)合基質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解的是，貫穿本申請，樹脂的吸附是指樹脂調(diào)節(jié)或減小或消除 來自復(fù)合基質(zhì)的信號(hào)檢測干擾，而沒有不利地影響基質(zhì)內(nèi)微生物的生存力。如本文中更詳 細(xì)描述的，下游測定W檢測樣品中微生物/病原體/細(xì)菌存在與否通常需要目標(biāo)是活的W 用于可靠的檢測。樹脂對(duì)可能存在于基質(zhì)中的其它樣品成分的物理作用是不重要，只要樹 脂對(duì)目標(biāo)微生物生存力沒有顯著不利的影響。
[0035] 更具體地，可用于實(shí)施本文所述方法的樹脂包括非官能聚合物樹脂吸附劑。樹脂 具有在本文被稱為孔的缺口/不規(guī)則表面。如本文所使用的非官能聚合物樹脂是不具備可 W與樣品成分顯著反應(yīng)的部分或官能團(tuán)的聚合物樹脂。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，非官能樹脂可用于實(shí)施所述方法，比如Rohm&Haas制造的 XAD樹脂，具體是XAD-4樹脂，其是苯乙締與二乙締基苯的非官能共聚物。
[0037] 應(yīng)當(dāng)理解的是，樹脂孔徑對(duì)實(shí)施本文所述方法不是至關(guān)重要的。一般地，樹脂不具 有允許細(xì)菌穿透進(jìn)入樹脂內(nèi)部的足夠大的孔徑。然而，某些樹脂具有大的內(nèi)表面的大孔結(jié) 構(gòu)，其允許大分子穿透進(jìn)入其內(nèi)部。運(yùn)樣的大孔樹脂完全適用于實(shí)施本發(fā)明，因?yàn)閷⒓?xì)菌包 載在孔內(nèi)不必然不利地影響微生物的生存力。至于大孔樹脂捕集細(xì)菌的程度，技術(shù)人員將 能夠確定包載的程度是否不利地影響樣品的下游分析。具有相對(duì)較小的孔的樹脂一一其中 吸附主要受樹脂的外表面影響，即微孔樹脂也適于實(shí)施本發(fā)明。
[003引特別優(yōu)選的樹脂是非官能聚合物吸附劑樹脂，比如XAD-4。運(yùn)樣的樹脂從樣品移除 干擾基質(zhì)組分，同時(shí)沒有不利地影響包含在生物樣品中的微生物的生存力?；诒疚奶峁?的指導(dǎo)，技術(shù)人員將能夠選擇其它合適的疏水多孔樹脂用于本文所述方法。
[0039] 在使用樹脂處理樣品后，樹脂與其上吸附的復(fù)合基質(zhì)與樣品分離。在染色前從復(fù) 合基質(zhì)分離目標(biāo)微生物是有優(yōu)勢的，因?yàn)閺?fù)合基質(zhì)比如碎牛肉提取物中的一些革蘭氏陰性 菌的染色強(qiáng)度不如緩沖液或含少量復(fù)合基質(zhì)的緩沖液中的細(xì)菌的染色強(qiáng)度高，并且添加增 大染料攝取的邸TA其本身并不能夠解決此問題。
[0040] 然后將樣品染色用于測定W檢測樣品中一種或多種目標(biāo)微生物存在與否。然后使 用流式細(xì)胞術(shù)分析分離的、濃縮的和染色的生物樣品是否存在目標(biāo)微生物。
[0041] 公開的方法預(yù)期獲得生物樣品。生物或環(huán)境樣品可W是復(fù)合基質(zhì)比如食物、上壤、 化妝品等的形式。合適的樣品是液體形式。
[0042] 如上面一般討論和在圖1中，制備生物或環(huán)境樣品用于分析。樣品制備將取決于 樣品的性質(zhì)。用于分析的生物或環(huán)境樣品的樣品制備對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，并 且因此不在本文詳細(xì)描述。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，首先將肉與緩沖液混合。使用將肉 與適當(dāng)?shù)木彌_液混合W獲得肉提取物的標(biāo)準(zhǔn)方案預(yù)期適合用于本文所述的方法。使用各 種技術(shù)完成混合，比如將肉樣品添加至適當(dāng)體積的憐酸鹽緩沖稀釋水并轉(zhuǎn)移至細(xì)菌分離器 袋（<50jiM過濾器-InterscienceBag系統(tǒng)：111625或等效物）并在細(xì)菌分離器（例如， Tekmar(Seward)StomacherL油Blender400或等效物）中混合。運(yùn)樣的方案對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員是眾所周知的，并且不在本文詳細(xì)