改進(jìn)復(fù)合基質(zhì)中微生物的分析的方法
【專利說明】改進(jìn)復(fù)合基質(zhì)中微生物的分析的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月13日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/779,766的申請(qǐng)日 的權(quán)益，并且設(shè)及2012年4月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/620,823,其與本申請(qǐng)共同擁 有，其公開內(nèi)容通過引用由此并入本文。 陽00引發(fā)明背景
[0004] 確定特定樣品中活的生物的同一性和總數(shù)目是非常重要的。其具體的重要性是通 過快速、高效和準(zhǔn)確地監(jiān)控和鑒定食物中和環(huán)境中的致病生物，進(jìn)而監(jiān)測(cè)和確保食物和水 供應(yīng)的安全。 陽0化]實(shí)現(xiàn)此的一個(gè)運(yùn)樣的方法是總存活生物燈V0)測(cè)定（totalvi油ilityorganism assay)。TVO測(cè)定如今作為質(zhì)量控制應(yīng)用廣泛用于工業(yè)微生物領(lǐng)域。例如，TVO測(cè)定用于監(jiān) 測(cè)消費(fèi)食物產(chǎn)品比如肉中的細(xì)菌的數(shù)目和類型。TV0方法還可用于監(jiān)測(cè)飲用水中的細(xì)菌群 體。當(dāng)然，監(jiān)測(cè)食物和水對(duì)確保食物和水供應(yīng)的安全消費(fèi)是至關(guān)重要的。
[0006]TV0測(cè)定的步驟一般包括：1)獲得試樣訊。在置于合適容器中的瓊脂（凝膠狀 營養(yǎng)物質(zhì)）上培養(yǎng)或平板接種。使微生物生長并基于在瓊脂上形成的菌落的數(shù)目計(jì)算菌落 形成單位（CRJ)。僅可在為菌落生長留出時(shí)間后計(jì)算CRJ。樣品通常被稀釋，并且當(dāng)計(jì)算 C即時(shí)考慮此稀釋因子（即，樣品與總體積的體積比）。
[0007] 還可W在各種瓊脂平板上培養(yǎng)樣品，所述瓊脂平板包含不同類型的選擇性培養(yǎng)基 W幫助分離目標(biāo)微生物，并且更精確和可靠地確定存在哪種類型的微生物。選擇性試劑 (例如，抗生素、抗真菌劑等）將消滅某些非目標(biāo)微生物（例如，不感興趣的細(xì)菌）。運(yùn)避免 了如果形成來自許多不同類型的微生物的菌落可能出現(xiàn)的假結(jié)果的可能性。
[0008] 選擇性試劑還可W相對(duì)于其它類型利于某些類型的微生物的生長。雖然TV0測(cè)定 允許檢測(cè)不同的微生物物種，例如不同的細(xì)菌物種，但是食品和環(huán)境微生物學(xué)家通常必須 在計(jì)數(shù)和鑒定之間選擇，而不能選擇二者。雖然選擇性試劑可被添加W利于特定類群生物 的生長，但是TV0測(cè)定通常基于正常健康細(xì)胞在富營養(yǎng)培養(yǎng)基中繁殖的能力（即，不進(jìn)行選 擇）。因此，TV0具有測(cè)量待測(cè)樣品中的微生物或一類群微生物的總數(shù)目的能力。然而，因 為缺少區(qū)分特定微生物的能力，TV0對(duì)作為整體的微生物群體可W是相對(duì)非特異性的。
[0009] 存在鑒定特定微生物，尤其是病原體的可用的眾多其它方法。運(yùn)樣的方法廣泛地 用于臨床環(huán)境。用于檢測(cè)微生物的方法通常取決于微生物培養(yǎng)的富集W增大目標(biāo)微生物的 數(shù)目和允許回生損傷的微生物。當(dāng)采用選擇性和鑒別平板接種時(shí)，研究者能夠?qū)⒛繕?biāo)生物 與背景微生物群落區(qū)分開。然而，結(jié)果幾乎總是非計(jì)數(shù)性的。換句話說，僅可W確定特定細(xì) 菌群體的存在與否，而不能定量。
[0010] 利用樣品富集和選擇性平板接種結(jié)果二者是耗時(shí)的測(cè)定，其通常甚至在可獲得初 步結(jié)果前花費(fèi)數(shù)天。雖然運(yùn)樣的富集和選擇性平板接種是確定樣品中微生物的數(shù)目和類型 的主要過程，但是它通?？苫ㄙM(fèi)數(shù)天W在對(duì)瓊脂上生長的菌落計(jì)數(shù)后獲得最終結(jié)果。獲得 結(jié)果所花費(fèi)的時(shí)間量是使用主要的TV0測(cè)定的最顯著的缺點(diǎn)。
[0011] 已經(jīng)開發(fā)了不同的方法，其試圖通過消除選擇性和鑒別平板接種步驟縮短檢測(cè)時(shí) 間。運(yùn)樣的方法包括DM雜交、凝集和酶免疫測(cè)定。雖然運(yùn)些可選技術(shù)已經(jīng)縮短了檢測(cè)時(shí) 間，但是培養(yǎng)富集步驟依然必要，因?yàn)檫\(yùn)些方法僅允許1〇3-1〇4CRJ的目標(biāo)病原體的最終檢 巧。。因此，假定陽性結(jié)果的確認(rèn)依然需要TVO測(cè)定。
[0012] 此外，不存在可用于分析生物樣品，尤其是食物樣品的通用方法或單個(gè)技術(shù)，W檢 測(cè)多種微生物存在與否。運(yùn)使得在測(cè)定微生物之前用于分離和隨后濃縮來自生物樣品的微 生物的樣品制備步驟成為用于檢測(cè)病原體的分子方法中的限速步驟，所述病原體包括食物 傳染的病原體。
[0013] 對(duì)于分離微生物的具體樣品制備技術(shù)，利用離屯、然后是沖洗和過濾步驟的技術(shù)是 沒有優(yōu)勢(shì)的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谔幚砥陂g導(dǎo)致微生物的顯著損失或損傷微生物。此外，整個(gè)過程是 不可W是自動(dòng)化處理的。
[0014] 為了實(shí)現(xiàn)從樣品分離微生物，已經(jīng)采用用于特定微生物的親和試劑。然而，用于從 復(fù)合基質(zhì)分離微生物的親和試劑也是復(fù)雜而難W運(yùn)用的，因?yàn)椋?)缺少結(jié)合至選擇性地來 自其它樣品成分的所有生物的通用親和試劑；2)不同生物結(jié)合至通用親和試劑的親和力 可變性；和3)將結(jié)合的生物洗脫回溶液的困難。
[0015] 用于鑒定食物和水中病原體的其它技術(shù)也是已知的。例如，已經(jīng)報(bào)道了流 式細(xì)胞術(shù)作為計(jì)數(shù)和鑒定微生物的快速技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是最初用于分離和分析真 核細(xì)胞群體的方法，但也已經(jīng)被用于評(píng)估和檢測(cè)微生物。具體而言，已經(jīng)被巧光染色 的微生物穿過光束。通過光吸收和散射二者的組合，獲得感興趣的微生物獨(dú)有的圖 案度reeuwer等人，Characterizationofuptakeandhydrolysisoffluorescein di曰cet曰te曰ndc曰rboxyfluoresceindi曰cet曰tebyintr曰cellul曰rester曰sesin S.cerevisiae,whichresultinaccumulationoffluorescentproduct,Appl. Elnviron.Micriobiol., 61 (4): 1614-9 (1995 年 4 月）；deBoer和Beumer,Methodology fordetectionandtypingoffoodbornemicroorganism,Int.J.Food. Microbiol.，50(1-2):119-30(1999 年 9 月））。
[0016] 流式細(xì)胞術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)是其快速且易于進(jìn)行。流式細(xì)胞術(shù)適于不同類型的樣品和 方法，使得它成為還可W是自動(dòng)化處理的魯棒性應(yīng)用。眾多流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用出現(xiàn)在工業(yè)生 物技術(shù)、食品和藥物質(zhì)量控制、飲用水與廢水的日常監(jiān)測(cè)、和±壤與天然水生生境中的微生 物生態(tài)研究中是毫不令人驚訝的。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)方法的結(jié)果密切關(guān)聯(lián)。 然而，流式細(xì)胞術(shù)具有其它的限制，比如需要染料標(biāo)記用于檢測(cè)的目標(biāo)微生物、高成本的設(shè) 備和需要對(duì)人員專業(yè)訓(xùn)練。此技術(shù)的擴(kuò)展和日常使用已經(jīng)開始緩解運(yùn)些缺點(diǎn)。
[0017] 然而，流式細(xì)胞術(shù)依然具有其它實(shí)踐問題，尤其是在分析源自被稱為"復(fù)合基 質(zhì)"的生物或環(huán)境樣品的背景下。復(fù)合基質(zhì)可W由干擾檢測(cè)生物或環(huán)境樣品中的微生物 的物質(zhì)組成。對(duì)檢測(cè)的進(jìn)一步限制是通過W下因素施加的：非特異性巧光的干擾、或小 于最佳檢測(cè)極限的微粒物質(zhì)、將方法應(yīng)用至固體或微粒食物樣品的困難、除非使用特殊 染色否則不能區(qū)分活細(xì)胞或死細(xì)胞、和在樣品處理期間還可W出現(xiàn)的對(duì)細(xì)胞存活的破壞 (Quintero-Bet曰ncourt等人，CryptosporidiumP曰rvum曰ndCyclospor曰c曰yet曰nensis:曰 reviewoflaboratorymethodsfordetectionofthewaterborneparasites,J. Microbiol.Methods, 49(3):209-24(2002 年 5 月））。
[0018] 樣品中干擾物質(zhì)或微粒物質(zhì)的存在增大了背景噪聲并使得使用流式細(xì)胞術(shù)的生 物或環(huán)境樣品的分析復(fù)雜化?？紤]到運(yùn)些缺點(diǎn)，由于研究者已經(jīng)認(rèn)為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)日常使 用不是非常有前景，許多研究者已經(jīng)不愿意徹底探索使用流式細(xì)胞術(shù)用于分析樣品，尤其 是那些包含微粒的。
[0019] 因?yàn)榧?xì)胞壁結(jié)構(gòu)和巧光染料的滲透性質(zhì)，有時(shí)在染色溶液中需要試劑比如邸TA W使革蘭氏陰性菌細(xì)胞的外膜不穩(wěn)定和增大染料攝取。復(fù)合基質(zhì)比如碎牛肉提取物中的一 些革蘭氏陰性菌的染色強(qiáng)度不如緩沖液或含少量復(fù)合基質(zhì)的緩沖溶液中的細(xì)菌的染色強(qiáng) 度高，并且添加邸TA不能解決運(yùn)些類型樣品的低染色強(qiáng)度問題。結(jié)果，某些生物的染色群 體非常接近背景，并且低信號(hào)與背景比將最終影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏性。
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