一種達(dá)托霉素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及達(dá)托霉素沉淀方法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種達(dá)托霉素的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]達(dá)托霉素是一類稱為環(huán)酯肽類新抗生素家族的第一個產(chǎn)品。它是從小鏈霉菌{Streptomyces parvus)發(fā)酵液當(dāng)中提取得到的十三個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)新穎的環(huán)脂肽類抗生素，其中十個氨基酸構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在環(huán)外癸酸和色氨酸發(fā)生酯化。它不僅具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且其作用模式也與任一已獲準(zhǔn)抗生素不同。它能在多個方面破壞細(xì)菌細(xì)胞膜功能，由此迅速殺死革蘭陽性菌。達(dá)托霉素除能作用于大多數(shù)臨床相關(guān)革蘭陽性菌外，更重要的是在體外對已呈甲氧西林(methicillin)、萬古霉素和利奈唑胺等耐藥性分離菌株仍具強力活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

達(dá)托霉素為發(fā)酵產(chǎn)物，通過發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵濾液，發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的色素及與達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)相近似的副產(chǎn)物如脫水達(dá)托霉素，因此達(dá)托霉素的提取純化方法較復(fù)雜。一般達(dá)托霉素產(chǎn)生菌，生產(chǎn)能力不穩(wěn)定，產(chǎn)量較低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，雜質(zhì)較多，導(dǎo)致后提取工作較為復(fù)雜，大大地增加了后序的提純難度，難以獲得高純度的最終產(chǎn)物，從而無法產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0003]對達(dá)托霉素后序的提取純化方法已經(jīng)有不少文獻報導(dǎo)，大致工藝為:發(fā)酵液經(jīng)超濾、納濾、陽離子樹脂吸附酸洗、陰離子樹脂中和，納濾濃縮、結(jié)晶。膜過濾收率達(dá)到98 -99%，產(chǎn)品經(jīng)結(jié)晶后純度也能得到98.5%以上。但達(dá)托霉素是個兩性物質(zhì)，等電點約是PH4-5，在不同的pH條件下，它的溶解性是不同的，尤其是達(dá)托霉素存在有大量的同系物、異構(gòu)體，這些雜質(zhì)在性質(zhì)上與達(dá)托霉素很相似，因此，通過這么簡單的工藝，在產(chǎn)業(yè)上要分離純化甚至結(jié)晶達(dá)托霉素是很困難的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種達(dá)托霉素的提取方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:本發(fā)明提供一種達(dá)托霉素的提取方法，包括以下步驟: a、先將發(fā)酵液中達(dá)托霉素富集，再將富集得到的達(dá)托霉素粗提取，其中粗提取采用酸性柱層析，再用中性柱層析，層析后得到達(dá)托霉素發(fā)酵液。
[0006]b、將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)ρΗ2.0-4.5后，用膜孔徑為0.01 μ m-0.1 μ m的陶瓷膜進行過濾，然后用PH2.0-4.0的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用PH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液；
c、在沉淀容器中沉淀步驟b中所得的達(dá)托霉素，得到晶體，并且攪拌該晶體漿料，將PH值連續(xù)調(diào)節(jié)至所需程度，直至完全沉淀，得到晶體沉淀物；
d、經(jīng)過冷凍干燥達(dá)托霉素制備液得到達(dá)托霉素。
[0007]本發(fā)明優(yōu)選的，根據(jù)步驟c中，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為5.0%?30.0%。
[0008]本發(fā)明優(yōu)選的，所述機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮。
[0009]本發(fā)明優(yōu)選的，所述機溶劑加入量為:甲醇為2?6倍結(jié)晶液體積；乙醇為1.5?5.5倍結(jié)晶液體積；異丙醇為1.2?5倍結(jié)晶液體積；丙酮為1.0?4.5倍結(jié)晶液體積。
[0010]本發(fā)明優(yōu)選的，根據(jù)步驟c中，結(jié)晶過程起始溫度為25?60°C ;結(jié)晶過程終點溫度為O?30°C ;結(jié)晶過程降溫速度為0.5?5°C /分鐘。
[0011]本發(fā)明的有益效果如下:
采用上述方案，本發(fā)明通過聚乙烯膜過濾，得到的澄清濾液通過大孔吸附色譜樹脂柱，達(dá)托霉素被吸附在大孔吸附色譜樹脂柱上，沉淀過程易控制，混合液易過濾，得到的達(dá)托霉素堿顏色淺，粉末松散，易溶解；本發(fā)明具有沉淀方法簡便和工藝流程適用于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
[0012]
【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明所述一種達(dá)托霉素的提取方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0015]請參閱圖1，本發(fā)明提供一種達(dá)托霉素的提取方法，包括以下步驟:
a、先將發(fā)酵液中達(dá)托霉素富集，再將富集得到的達(dá)托霉素粗提取，其中粗提取采用酸性柱層析，再用中性柱層析，層析后得到達(dá)托霉素發(fā)酵液。
[0016]b、將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)PH2.0-4.5后，用膜孔徑為0.0lym-0.1 ym的陶瓷膜進行過濾，然后用PH2.0-4.0的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用PH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液；
c、在沉淀容器中沉淀步驟a中所得的達(dá)托霉素，得到晶體，并且攪拌該晶體漿料，將PH值連續(xù)調(diào)節(jié)至所需程度，直至完全沉淀，得到晶體沉淀物，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為5.0%?30.0%，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為5.0%?30.0%，所述機溶劑加入量為:甲醇為2?6倍結(jié)晶液體積；乙醇為1.5?5.5倍結(jié)晶液體積；異丙醇為1.2?5倍結(jié)晶液體積；丙酮為1.0?4.5倍結(jié)晶液體積，結(jié)晶過程起始溫度為25?60°C ;結(jié)晶過程終點溫度為O?30°C ;結(jié)晶過程降溫速度為0.5?5°C /分鐘；
d、經(jīng)過冷凍干燥達(dá)托霉素制備液得到達(dá)托霉素。。
[0017]實施例一:
本發(fā)明包括以下步驟:
a、先將發(fā)酵液中達(dá)托霉素富集，再將富集得到的達(dá)托霉素粗提取，其中粗提取采用酸性柱層析，再用中性柱層析，層析后得到達(dá)托霉素發(fā)酵液
b、將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH3.0后，用膜孔徑為0.05 μ m的陶瓷膜進行過濾，然后用PH3.0的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用pH9的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液； C、在沉淀容器中沉淀步驟a中所得的達(dá)托霉素，得到晶體，并且攪拌該晶體漿料，將PH值連續(xù)調(diào)節(jié)至所需程度，直至完全沉淀，得到晶體沉淀物，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為21.0%，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為18.0%，所述機溶劑加入量為:甲醇為4倍結(jié)晶液體積；乙醇為3.5倍結(jié)晶液體積；異丙醇為2.3倍結(jié)晶液體積；丙酮為3.3倍結(jié)晶液體積，結(jié)晶過程起始溫度為50°C ;結(jié)晶過程終點溫度為10C ;結(jié)晶過程降溫速度為5°C /分鐘；
d、經(jīng)過冷凍干燥達(dá)托霉素制備液得到達(dá)托霉素。
[0018]綜上所述，采用上述方案，本發(fā)明通過聚乙烯膜過濾，得到的澄清濾液通過大孔吸附色譜樹脂柱，達(dá)托霉素被吸附在大孔吸附色譜樹脂柱上，沉淀過程易控制，混合液易過濾，得到的達(dá)托霉素堿顏色淺，粉末松散，易溶解；本發(fā)明具有沉淀方法簡便和工藝流程適用于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
[0019]以上僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種達(dá)托霉素的提取方法，其特征在于，包括以下步驟:a、先將發(fā)酵液中達(dá)托霉素富集，再將富集得到的達(dá)托霉素粗提取，其中粗提取采用酸性柱層析，再用中性柱層析，層析后得到達(dá)托霉素發(fā)酵液。2.b、將達(dá)托霉素發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH2.0-4.5后，用膜孔徑為0.01iim-0.1 ym的陶瓷膜進行過濾，然后用PH2.0-4.0的酸性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，棄濾液，再用PH8-10的堿性水溶液循環(huán)洗滌陶瓷膜，收集達(dá)托霉素濾液；c、在沉淀容器中沉淀步驟b中所得的達(dá)托霉素，得到晶體，并且攪拌該晶體漿料，將PH值連續(xù)調(diào)節(jié)至所需程度，直至完全沉淀，得到晶體沉淀物；d、經(jīng)過冷凍干燥達(dá)托霉素制備液得到達(dá)托霉素。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種達(dá)托霉素的提取方法，其特征在于，根據(jù)步驟c中，通過在含凈抗生素活性洗脫液中加入與水互溶的有機溶劑來結(jié)晶，結(jié)晶前溶液中達(dá)托霉素含量為 5.0%?30.0%4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種達(dá)托霉素的提取方法，其特征在于，所述機溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種達(dá)托霉素的提取方法，其特征在于，所述機溶劑加入量為:甲醇為2?6倍結(jié)晶液體積；乙醇為1.5?5.5倍結(jié)晶液體積；異丙醇為1.2?5倍結(jié)晶液體積；丙酮為1.0?4.5倍結(jié)晶液體積。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種達(dá)托霉素的提取方法，其特征在于，根據(jù)步驟b中，結(jié)晶過程起始溫度為25?60°C ;結(jié)晶過程終點溫度為0?30°C ;結(jié)晶過程降溫速度為0.5?.5°C /分鐘。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種達(dá)托霉素的提取方法，先將發(fā)酵液中達(dá)托霉素富集，再將富集得到的達(dá)托霉素粗提取，其中粗提取采用酸性柱層析，再用中性柱層析，層析后得到達(dá)托霉素發(fā)酵液。本發(fā)明通過聚乙烯膜過濾，得到的澄清濾液通過大孔吸附色譜樹脂柱，達(dá)托霉素被吸附在大孔吸附色譜樹脂柱上，沉淀過程易控制，混合液易過濾，得到的達(dá)托霉素堿顏色淺，粉末松散，易溶解；本發(fā)明具有沉淀方法簡便和工藝流程適用于大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
【IPC分類】C07K1/36, C07K1/30, C07K1/16, C07K1/34, C07K7/08
【公開號】CN105111285
【申請?zhí)枴緾N201510668192
【發(fā)明人】霍進銘
【申請人】霍進銘
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年10月17日