一種從中藥決明子中提取蛋白質(zhì)的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，是一種從中藥決明子中提取蛋白質(zhì)的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]決明子，中藥名。是豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，以其有明目之功而名之。秋季采收成熟果實(shí)，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)。決明子味苦、甘、咸，性微寒，入肝、腎、大腸經(jīng)；潤(rùn)腸通便，降脂明目，治療便秘及高血脂，高血壓。清肝明目，利水通便，有緩瀉作用，降血壓降血脂。
[0003]關(guān)于決明子古著論述有:
1、《本草綱目》:“除肝膽風(fēng)熱，淫膚白膜，青盲。”
2、《中華本草》述其應(yīng)用較為廣泛，載曰:“清肝益腎，明目，利水通便。主治目赤腫痛，羞明淚多、青盲、雀目、頭痛頭暈、視物昏暗、肝硬化腹水、小便不利，習(xí)慣性便秘。外治腫毒、癬疾?！?br> 3、《本經(jīng)》:“治青盲，目淫膚赤白膜，眼赤痛，淚出，久服益精光?！?br> 4、《本草經(jīng)疏》:“決明子，其味咸平，《別錄》益以苦甘微寒而無(wú)毒。咸得水氣，甘得土氣，苦可泄熱，平合胃氣，寒能益陰泄熱，足厥陰肝家正藥也。亦入膽腎。肝開(kāi)竅于目，瞳子神光屬腎，故主青盲目淫，膚赤白膜，眼赤痛淚出?！秳e錄》兼療唇口青?！侗窘?jīng)》久服益精光者，益陰泄熱、大補(bǔ)肝腎之氣所致也?！?br> 5、《本草求真》決明子，除風(fēng)散熱。凡人目淚不收，眼痛不止，多屬風(fēng)熱內(nèi)淫，以致血不上行，治當(dāng)即為驅(qū)逐；按此苦能泄熱，咸能軟堅(jiān)，甘能補(bǔ)血，力薄氣浮，又能升散風(fēng)邪，故為治目收淚止痛要藥。并可作枕以治頭風(fēng)，但此服之太過(guò)，搜風(fēng)至甚，反招風(fēng)害，故必合以蒺藜、甘菊、枸杞、生地、女貞實(shí)、槐實(shí)、谷精草相為補(bǔ)助，則功更勝。謂之決明，即是此意?！?br> 6、《本草正義》:“決明子明目，乃滋益肝腎，以鎮(zhèn)潛補(bǔ)陰為義，是培本之正治，非如溫辛散風(fēng)，寒涼降熱之止為標(biāo)病立法者可比，最為有利無(wú)弊?！?br> 決明子蛋白質(zhì)的總含量達(dá)18.56-22.93%，是主要的藥用部分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)出一種從中藥決明子中提取蛋白質(zhì)的工藝，能從決明子中進(jìn)行分化提純出決明子蛋白質(zhì)，以備進(jìn)行藥物制備及研究，整個(gè)工藝精湛、實(shí)用、設(shè)計(jì)科學(xué)合理。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種從中藥決明子中提取蛋白質(zhì)的工藝，包括以下具體工藝步驟:
I)決明子粗蛋白的提取，包括:
1-1)在常溫條件下，將決明子碾碎為20— 80目粉末后過(guò)篩，后在4-8°C環(huán)境下用石油醚或環(huán)己烷浸泡脫脂24-48小時(shí)，分2-4次進(jìn)行； 1-2)回收溶劑，殘?jiān)碔g: 10-50ml的體積浸泡于50mmol pH為7.8的KH2PO4-NaOH中8-12小時(shí)，重復(fù)3-5次，合并提取液；
1-3)提取液離心24-28min，取上清液；上清液邊攪拌邊加入硫酸銨至48% -52%的飽和度，離心分離，保留沉淀；沉淀物在分子量3500-7800的透析袋中進(jìn)行脫鹽；
1-4)冷凍干燥儀中-30°C至_60°C溫度下進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末狀決明子粗蛋白，-25 °C冷藏備用；
2)決明子粗蛋白的提純，包括:
2-1)將上述方法得到的粉末狀決明子粗蛋白充分溶解于18mmol-22mmolpH為7.2-7.8的Tris-HCl的緩沖液中；
2-2)用分子篩層析柱進(jìn)行初步純化，分子篩層析柱上樣前先用含有0.2mol NaCl的步驟2-1)所得緩沖液平衡2-5倍柱體積；每次上樣量為200 μ 1-220 μ 1，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為0.4-0.6ml/min ;決明子粗蛋白經(jīng)分子篩層析被分成5個(gè)峰:分別為peakl、peak2、peak3、peak4和 peak5 ；
3)決明子蛋白質(zhì)peak2的分離純化，包括:用離子交換柱純化peak2，離子交換柱按照A液與B液依次交替的程序平衡，A液為18mmol-22mmol pH為7.2-7.8的Tris-HCl，B液為0.8mol NaCl的A液；將peak2濃縮、脫鹽，上樣量為30mg-40mg/ml ;離子交換柱用
0-1.0mol 的 NaCl 梯度、18mmol-22mmol pH 為 7.2-7.8 的 Tris-HCl 的緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為0.8-1.5ml/min ；peak2經(jīng)離子交換柱層析被分成3個(gè)峰，分別為:peakl、peakl I和peakl 11，收集 peakl I。
[0006]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟1-1)中，石油醚脫脂時(shí)間為32小時(shí)，分2次進(jìn)行。
[0007]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟1-3)中，脫鹽時(shí)，選分子量3500的透析袋，透析液為雙蒸水，每6小時(shí)更換一次透析液。
[0008]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟I)中，脫鹽后，先在_20°C冰箱中冷凍24小時(shí)，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥儀-60°C中冷凍干燥64小時(shí)。
[0009]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟2-1)中，在進(jìn)行用分子篩層析柱進(jìn)行初步純化時(shí)，分子篩的再生按0.1mol HCl — H2O — 0.5mol NaOH — H2O —緩沖液的程序進(jìn)行，采用緩沖液是 0.2mol NaCl、20mmol pH 為 7.2 的 Tris-HCl0
[0010]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟2-1)中，選緩沖液平衡2倍柱體積，每次上樣量為200 μ I，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為0.5ml/min。
[0011]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟3)中，在進(jìn)行決明子蛋白質(zhì)peak2的分離純化時(shí)，離子交換柱的再生按0.1mol HCl — H2O — 0.5mol NaOH — H2O — A液的程序進(jìn)行:緩沖液中A液為20mmol Tris-HCl, pH為7.2。
[0012]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟3)中，在進(jìn)行決明子蛋白質(zhì)peak2的分離純化時(shí)，離子交換柱的平衡按照1ml A液一20ml B液一20ml A液一20ml B液一1mlA液的程序進(jìn)行，用0-1.0mol的NaCl梯度、20mmol pH 7.2的Tris-HCl緩沖液洗脫，流速為 1.2ml/min。
[0013]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述步驟3)中，在鹽濃度為0.28mol處洗脫得到中藥決明子蛋白質(zhì)。
[0014]進(jìn)一步的為更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，該從中藥決明子中提取的蛋白質(zhì)能應(yīng)用在制備降脂藥物中。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
本發(fā)明能從決明子中進(jìn)行分化提純出決明子蛋白質(zhì)，以備進(jìn)行藥物制備及研究，整個(gè)工藝精湛、實(shí)用、設(shè)計(jì)科學(xué)合理。
[0016]本發(fā)明從決明子中分離得到一種新的蛋白質(zhì)，并對(duì)該蛋白進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)及初級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定:該蛋白的等電點(diǎn)為4.80，分子量為19680，N-端測(cè)序結(jié)果為IPYISASFPLNIEFLPSE，CD結(jié)果表明peakl 11的α螺旋比例為12.8 %，β折疊比例為55.4%，無(wú)規(guī)卷曲為31.8%。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(TOB)搜索證明該蛋白缺乏同源蛋白，為一新的蛋白質(zhì)。
[0017]本發(fā)明所提取的決明子蛋白質(zhì)，采用兩性霉素B細(xì)胞法，對(duì)其的活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明該蛋白能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，具有明顯的降脂作用。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0019]實(shí)施例1:
一種從中藥決明子中提取蛋白質(zhì)的工藝，包括以下具體工藝步驟:
1)決明子粗蛋白的提取，包括:
1-1)在常溫條件下，將決明子碾碎為20— 80目粉末后過(guò)篩，后在4-8°C環(huán)境下用石油醚或環(huán)己烷浸泡脫脂24-48小時(shí)，分2-4次進(jìn)行；
1-2)回收溶劑，殘?jiān)碔g: 10-50ml的體積浸泡于50mmol pH為7.8的KH2PO4-NaOH中8-12小時(shí)，重復(fù)3-5次，合并提取液；
1-3)提取液離心24-28min，取上清液；上清液邊攪拌邊加入硫酸銨至48% -52%的飽和度，離心分離，保留沉淀；沉淀物在分子量3500-7800的透析袋中進(jìn)行脫鹽；
1-4)冷凍干燥儀中-30°C至_60°C溫度下進(jìn)行冷凍干燥，得到粉末狀決明子粗蛋白，-25 °C冷藏備用；
2)決明子粗蛋白的提純，包括:
2-1)將上述方法得到的粉末狀決明子粗蛋白充分溶解于18mmol-22mmolpH為
7.2-7.8的Tris-HCl的緩沖液中；
2-2)用分子篩層析柱進(jìn)行初步純化，分子篩層析柱上樣前先用含有0.2mol NaCl的步驟2-1)所得緩沖液平衡2-5倍柱體積；每次上樣量為200 μ 1-220 μ 1，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為0.4-0.6ml/min ;決明子粗蛋白經(jīng)分子篩層析被分成5個(gè)峰:分別為peakl、peak2、peak3、peak4和 peak5 ；
3)決明子蛋白質(zhì)peak2的分離純化，包括:用離子交換