新穎方法
【專利說明】新穎方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及通過將TET家族基因、其衍生物或片段引入細胞以增強細胞效力的方 法。本發(fā)明還涉及用于制備具有增強效力的細胞的方法和試劑盒，以及所述細胞的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 據(jù)認為，干細胞的使用可以從根本上改變人類疾病的治療。已知干細胞具有高水 平的效力和自我更新，這意味著它們可以分化成多種細胞類型。這種有利的特性可以在器 官和組織的產生或修復中使用。
[0004] 胚胎干（ES)細胞的分離已經在干細胞技術和研究中帶來很大進步。ES細胞是多 能的，因此它們可被誘導分化成隨后可被利用的多種細胞類型，例如，在科學動物模型或細 胞移植療法中使用。然而，ES細胞尚未滿足它們作為在疾病的治療中現(xiàn)在所面對的大多數(shù) 問題的方案的預期。例如，已被證實的是，ES細胞的移植面臨與當前器官移植一樣的排斥 問題。此外，鑒于在收獲ES細胞期間胚胎遭到破壞的事實，這些細胞的使用引發(fā)了倫理問 題。
[0005] 最近，科學家已開發(fā)出產生誘導多能干（iPS)細胞（如W0 2007/069666中所述） 的方法，所述方法允許患者自身的體細胞去分化成多能狀態(tài)，從而克服與ES細胞相關的倫 理問題。然而，來自人和嚙齒動物譜系之外的其它哺乳動物的iPS細胞和ES細胞在幾乎所 有的情況下都缺少完全的多能性。
[0006] 此外，作為多能細胞，來自任何物種的ES和iPS細胞不能形成胚外譜系的組織，并 且必須注射到宿主囊胚以產生完整的有機體。
[0007]W0 2010/037001描述使用TET蛋白家族來調節(jié)和檢測DNA的胞嘧啶甲基化狀態(tài)以 便重編程干細胞的方法。
[0008] 因此需要產生具有更高效力的細胞（如全能細胞）以用于在干細胞技術中使用的 方法。
[0009]發(fā)明概述
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供增強細胞效力的方法，其中所述方法包括以下步驟： 將TET家族基因、其衍生物或片段引入細胞中。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供制備具有增強效力的細胞的方法，所述方法包括以 下步驟：將TET家族基因、其衍生物或片段引入細胞中。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供可通過本文所定義的方法獲得的具有增強效力的細 胞。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包含SEQIDN0:11或13的TET3同工型的核酸。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供包含如本文所定義的核酸的載體。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供如本文所定義的核酸或如本文所定義的載體在增強 細胞效力的方法中的用途。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于在療法中的使用的如本文所定義的具有增強效 力的細胞。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供試劑盒，所述試劑盒包括含有TET家族基因、其衍生 物或片段的載體，和根據(jù)如本文所定義的方法來使用所述試劑盒的說明書。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1 :5'Tet3基因座的示意圖。圖不是按比例繪制。虛線代表多個外顯子和內含 子。箭頭表示用于啟動子使用分析的qRT-PCR引物的位置（參見實施例部分）。所指示的 起始密碼子與全長TET3蛋白同框。'Cat' =催化結構域。
[0020] 圖2 :啟動子使用和編碼CXXC的外顯子的并入。示出了相對于參考基因Atp5b和 Hspcb的平均值的轉錄水平。除了卵母細胞（其具有單個值），所示的值是兩個生物學平行 測定值的平均值，范圍被示出為誤差線條。EB:胚狀體。
[0021] 圖3:在由Tet3變體1轉染的分選細胞中通過qPCR進行的候選基因的表達分析。 示出了相對于參考基因Atp5b和Hspcb的平均值的轉錄水平。Mut:催化非活性突變體。
[0022] 圖4 :在由Tet3變體1轉染的分選細胞中通過qPCR進行的對照基因的表達分析。 示出了相對于參考基因Atp5b和Hspcb的平均值的轉錄水平。Mut:催化非活性突變體。
[0023] 圖5:在由Tet3變體3轉染的分選細胞中通過qPCR進行的候選基因的表達分析。 示出了相對于參考基因Atp5b和Hspcb的平均值的轉錄水平。Mut:催化非活性突變體。
[0024] 圖6:由Tet3變體1轉染的分選細胞中的表達水平的散點圖。每個點代表單個基 因。用黑色來指示通過qPCR檢測的候選基因（參見實施例4)和幾個家族成員，其中用箭 頭標記一些示例性基因。
[0025]圖7:由Tet3變體1催化突變體轉染的分選細胞中的表達水平的散點圖。每個點 代表單個基因。用黑色來指示通過qPCR檢測的候選基因（參見實施例4)和幾個家族成員， 其中用箭頭標記一些示例性基因。
[0026] 圖8:示出表達Tet3變體1的胚胎干細胞中單細胞表達數(shù)據(jù)的結果的熱圖。
[0027] 圖9:指示表達TET3的亞群中類全能細胞比例的圖。
[0028] 圖10 :TET3表達的定量RT-PCR分析。示出了相對于E14( = 1)的轉錄水平。值 是兩個獨立平行測定值的平均值；誤差線條指示范圍。
[0029] 圖11 :6天轉分化測定后的菌落形態(tài)的相差顯微鏡檢查。圖像代表觀察到的菌落 形態(tài)的范圍。
[0030] 圖12 :6天轉分化測定后的CD40表達的流式細胞分析。在TS細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng) 6天后，將細胞用山羊a-⑶40-次抗體（R&DSystem)、然后抗山羊AlexaFluor647二次 抗體（Invitrogen)染色。A:點圖針對單個細胞，在Y-軸上示出正向散射寬度值（FSC-W)， 并且在X-軸上示出640nm的熒光值（即⑶40信號）。指示了針對稱為⑶40陽性的閾值， 以及超過這個水平的細胞百分比。對總細胞群體中的學生t檢驗表明對于兩種過表達TET3 的細胞系來說，在CD40陽性細胞中相對于E14ES細胞的非常顯著增加（在兩種情況下 p〈0. 0001)。B.每個細胞系中稱為⑶40陽性的細胞百分比的定量。
[0031] 發(fā)明詳述
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供增強細胞效力的方法，其中所述方法包括以下步驟： 將TET家族基因、其衍生物或片段引入細胞。
[0033] 本文提到的'增強效力'涉及具有增加的分化成不同細胞類型的能力的細胞。已 知全能細胞是具有最高效力的細胞。其次是多能、多潛能、寡能和單能細胞。
[0034] 在一個實施方案中，細胞的效力被增強至多能狀態(tài)，如真實多能狀態(tài)。
[0035] 本文提到的'多能'涉及具有分化成不同細胞類型的潛力的細胞。這些細胞比全 能細胞更受限，原因在于單獨的多能細胞不能發(fā)育成胎兒或成年生物體，因為多能細胞不 能分化成胚外細胞。因此，必須使用供體囊胚細胞以產生完整的有機體。
[0036] 如本文所述，產生iPS細胞的方法在本領域中是公知的，然而這些細胞已被證明 缺乏完全的多能性，因為它們保留其供體體細胞的表觀遺傳記憶（Kim等人（2011)Nature 467, 285-290頁）。因此，這些細胞不被認為是真實多能的，因為它們不具有如天然的多能 細胞分化成多種細胞類型一樣的能力。
[0037] 因此，本文提到的'真實多能狀態(tài)'涉及具有如天然的多能細胞分化成多種細胞類 型一樣的能力（即它們是完全的多能）的細胞。特別是，真實/完全的多能細胞可以分化 成胚胎的三個胚層（即內胚層、中胚層或外胚層）中的任何層。
[0038] 在一個實施方案中，細胞的效力被增強至多能狀態(tài)。
[0039] 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供將細胞重編程至全能狀態(tài)的方法，其中所述方 法包括以下步驟：將TET家族基因、其衍生物或片段引入細胞。
[0040] 本文提到的'全能'涉及具有分化成不同細胞類型的潛力的細胞，包括包含胚外組 織的細胞。因此，全能細胞具有能夠發(fā)育成完整的生物，而不需要使用宿主產生的囊胚細 胞的優(yōu)點。應理解，提到的'全能，細胞包括'類全能，細胞（即與全能細胞有高度的相似 性的細胞），例如與全能細胞的高程度轉錄或表觀遺傳相似性（參見Macfarlan等（2012) Nature487, 57-63頁，描述了產生全能性獲得的基因表達轉移）。此外，如本文所用提到的 '全能'或'類全能'細胞是指具有比多能細胞更高效力的細胞。
[0041] 本文提到的'體細胞'是指構成生物體的任何類型的細胞，但排除生殖細胞和未分 化的干細胞。體細胞因此包括例如皮膚、心臟、肌肉、骨骼或血液細胞。
[0042] 由于細胞分化為特定細胞類型（例如皮膚、肌肉、血液等），它們失去其成為不同 細胞類型的能力（或潛力）。因此，重編程細胞回到多能狀態(tài)或全能狀態(tài)，使得它們可以被 操作成所期望的細胞類型是有利的。
[0043] 本文提到的'重編程'是指細胞被轉換回到不同的分化狀態(tài)的過程。本文所述的 發(fā)明將細胞重編程至全能狀態(tài)，從而提高其效力和分化成多種細胞類型的能力。
[0044] 當前干細胞技術依賴于ES細胞和iPS細胞的使用。然而，這兩種細胞類型都具有 一些缺點。例如，iPS細胞已被證實保留它們的供體體細胞的表觀遺傳記憶，所述表觀遺傳 記憶在天然多能細胞中是不存在的（Kim等（2011)Nature467,285-290頁）。此外，來自 人和嚙齒動物譜系之外的其它哺乳動物的ES和iPS細胞已被證實不是真實多能的。本發(fā) 明提供增強細胞的效力的狀態(tài)（例如，增強至全能狀態(tài)）的方法，從而克服這些與人ES和 iPS細胞相關聯(lián)的問題。
[0045] 如本文所示，使用TET家族基因（例如Tet3基因）可以增加細胞培養(yǎng)基中的類全 能干細胞的數(shù)量（參見圖9)。類全能干細胞的亞群已被證實具有增強效力，如通過其轉分 化至類滋養(yǎng)層細胞的能力所精確計量的（參見實施例7)。因此，