一種中東呼吸綜合征冠狀病毒ORF1a2基因檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物診斷試劑，涉及一種中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2 (MERS-CoV)基因檢測試劑盒，是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸篩查方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冠狀病毒是一大類能導(dǎo)致人類疾病的病毒，其臨床表現(xiàn)涵蓋了從普通感冒到嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)的一個很大的范圍。該類病毒也能在許多種動物中引起疾病。2012年底，在中東居民身上發(fā)現(xiàn)了一種新的冠狀病毒，這種冠狀病毒以往從未在人類中發(fā)現(xiàn)過。該病毒被命名為中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少50多例實驗室確診的人類感染病例。目前，所有感染MERS-CoV的病例都和中東地區(qū)有直接或間接的聯(lián)系，但是在其他國家近期前往中東旅行的人群中已發(fā)現(xiàn)局部的非持續(xù)的人際傳播發(fā)生。所有MERS-CoV感染病例主要表現(xiàn)為呼吸道疾病，也有一些后續(xù)并發(fā)癥報道，如急性腎功能衰竭，多器官功能衰竭，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和消耗性凝血病等。此外，許多病例出現(xiàn)胃腸道癥狀，如腹瀉。超過一半的病例死亡。大多數(shù)病例至少存在一種合并的疾病，但許多病例既往身體健康。很小一部分病例合并感染有其他病原體，如流感病毒，副流感病毒，單純皰疹病毒和肺炎球菌等。截至2013年6月6日，實驗室確診病例的平均年齡為56歲(范圍2 - 94歲)，且多數(shù)是男性(72%)。MERS-CoV被認(rèn)為是一種動物病毒，偶爾感染人類并導(dǎo)致有限的人際傳播。該病毒已被證明在過去通常用于診斷性病毒培養(yǎng)的細(xì)胞中生長良好。
[0003]目前基于核酸的檢測方法是目前最普遍、最準(zhǔn)確的基因檢測技術(shù)，檢測方法主要包括PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)和基于分子雜交的基因芯片技術(shù)。目前仍以PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其常用的技術(shù)方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測效率低，尤其檢測多基因?qū)ο髸r更加費時費力；巢式PCR雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；多重PCR方法可以在一個反應(yīng)中同時檢測多個基因，但常規(guī)的電泳檢測結(jié)果很難判斷，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果；熒光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測儀器。基因芯片也是常用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)，目前一般采用玻璃片作為固相支持物，實驗過程需要相應(yīng)的點樣儀和芯片識讀儀，同樣成本較高。
[0004]2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了一種新的基因診斷技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)。其特征是針對靶基因的8個區(qū)域設(shè)計6種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒溫條件(65°C)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)，短時間擴增效率達(dá)到19-1Ow個拷貝。直接靠擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度或顯色反應(yīng)進行判斷是否發(fā)生反應(yīng)。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速廉價(不需要特定的貴重檢測設(shè)備，至于要簡單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、易檢測(直接進行目測判斷)等特點。
[0005]通過該項技術(shù)可以達(dá)到以下目的:一是檢測能力進一步提高，LAMP檢測技術(shù)的檢測限高于涂片法100-200倍，這樣就有利的解決了傳統(tǒng)的抗酸染色陽性檢出率較低的問題(有文獻表明30%左右)；二是由于經(jīng)典聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增技術(shù)對儀器設(shè)備要求較高(如PCR擴增儀，瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)等)、技術(shù)較為復(fù)雜，而LAMP檢測技術(shù)具有儀器設(shè)備要求簡單(只需要簡單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、檢測時間短(0.5-1.0小時)、特異性高(針對8個區(qū)域設(shè)計6種特異引物)等特點，因此，該檢測方法簡便、經(jīng)濟、快速、靈敏和特異，將具有非常好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的中東呼吸綜合征冠狀病毒核酸篩查方法，為了克服現(xiàn)有技術(shù)費時費力成本高的缺陷，提供一種簡便、經(jīng)濟、快速、靈敏和特異的中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因檢測試劑盒。
[0007]本發(fā)明這樣實現(xiàn)的:一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)原理對樣本中中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因進行核酸檢測。通過使用特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)平臺擴增靶基因0RFla2的特定區(qū)域，在陽性和陰性質(zhì)控和內(nèi)對照檢測體系的輔助下，從分子水平對樣本中的中東呼吸綜合征冠狀病毒進行篩查或檢測。
[0008]所述的LAMP技術(shù)平臺擴增靶基因的特定區(qū)域是指中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因的特定靶赫酸序列區(qū)域。
[0009]進一步地，在本發(fā)明所述的篩查檢測方法中，在LAMP對樣本篩查過程中引入了陰陽性對照檢測系統(tǒng)，陽性對照質(zhì)控品為相同于擴增冠狀病毒靶基因0RFla2的RNA，陰性對照質(zhì)控品為不相同于擴增冠狀病毒靶基因0RFla2的RNA，并使用時間分辨濁度法或Smartgreen熒光染料紫外燈下顯色法同時檢測陰陽對照和中東呼吸綜合征冠狀病毒靶基因擴增產(chǎn)物。
[0010]在現(xiàn)有的LAMP技術(shù)的公開文獻中，沒有將LAMP用于中東呼吸綜合征冠狀病毒篩查的報道。本發(fā)明通過使用特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)平臺擴增靶基因0RFla2的特定區(qū)域，在一系列和內(nèi)對照檢測體系的輔助下，從分子水平對樣本中的中東呼吸綜合征冠狀病毒進行篩查或檢測。
[0011]本發(fā)明具有嚴(yán)格的鑒別篩查診斷體系，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。該鑒別篩查診斷系統(tǒng)由陽性和陰性質(zhì)控品，內(nèi)對照質(zhì)控品以及相關(guān)擴增和檢測體系組成。
[0012]本發(fā)明中鑒別篩查診斷系統(tǒng)的陽性和陰性質(zhì)控品是每批試驗檢測結(jié)果是否有效的重要標(biāo)志。對于每批試驗，必須引入一個陰性質(zhì)控品的檢測，以保證反應(yīng)體系不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；對于每批實驗，必須引入一個中東呼吸綜合征冠狀病毒陽性質(zhì)控品的檢測，以保證反應(yīng)體系不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。針對中東呼吸綜合征冠狀病毒的陽性質(zhì)控品是人工構(gòu)建的包含中東呼吸綜合征冠狀病毒待檢靶序列的質(zhì)粒DNA。
[0013]本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的特異性擴增產(chǎn)物均通過核酸合成設(shè)備制備。核酸合成設(shè)備可選用不同廠家，不同型號的產(chǎn)品，也可委托相關(guān)的基因公司合成。所有引物按照LAMP引物設(shè)計原則，通過日本榮研化學(xué)網(wǎng)站(WWW.eiken.c0.jp)上引物設(shè)計軟件設(shè)計。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的LAMP體系及反應(yīng)程序均由發(fā)明人設(shè)計，中東呼吸綜合征冠狀病毒0RFla2基因的核酸特異性引物序列、LAMP反