T細(xì)胞亞型促進(jìn)nk細(xì)胞增殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2013年末，SCIENCE雜志評選出十大突破性科學(xué)成就中，腫瘤的免疫治療名列第一。與傳統(tǒng)抗腫瘤治療手段相比，細(xì)胞治療應(yīng)用范圍廣泛，尤其對微小轉(zhuǎn)移灶的療效更是明顯，而且其毒副作用要明顯低于放化療。隨著腫瘤生物學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，免疫細(xì)胞治療是目前最有希望取得突破的治療手段，并已成為繼傳統(tǒng)腫瘤治療方法手術(shù)和放化療后的第四種腫瘤治療模式。目前應(yīng)用最廣泛的工具細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，但是由于來自腫瘤患者自體的淋巴細(xì)胞長期收到腫瘤微環(huán)境的免疫編輯，導(dǎo)致其腫瘤識別和殺傷等多方面的低能。如不通過基因修飾技術(shù)為T細(xì)胞加載特異性識別受體，則很多腫瘤患者無法從該類治療中獲益。也有人常用異體淋巴細(xì)胞作為工具細(xì)胞為腫瘤患者治療，但是由于受MHC配型限制，很多患者產(chǎn)生了嚴(yán)重的移植物抗宿主反應(yīng)(GvHD)。人體中NK細(xì)胞被定義為⑶3⑶56+淋巴細(xì)胞，可以通過識別腫瘤細(xì)胞表面發(fā)生突變或表達(dá)缺失的MHC抗原而激活自體殺傷功能。針對能夠表達(dá)正常MHC分子的腫瘤細(xì)胞，NK細(xì)胞還能通過其表面的活化受體進(jìn)行識別?；罨荏w包括NKG2D、DNlM-U NKG2C.2B4和自然細(xì)胞毒性受體(NCR:NKp30,NKp44和NKp46)等。盡管近期的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境會釋放假活化信號，使得NK細(xì)胞尚未接觸到腫瘤時(shí)其抗腫瘤活性已被消耗殆盡。當(dāng)NK細(xì)胞的數(shù)量足以克服該影響后，那將會對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用。
[0003]由于NK細(xì)胞數(shù)量稀少，僅占外周血淋巴細(xì)胞的5%左右，即使經(jīng)過體外擴(kuò)增后仍無法獲得滿意的NK細(xì)胞數(shù)量用以后期治療。因此，突破NK細(xì)胞治療瓶頸的關(guān)鍵即是建立高效的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種⑶3+⑶56+T細(xì)胞的新用途。
[0005]本發(fā)明所提供的⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞的新用途，具體可為如下三種中的任一種:
[0006](I)⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞在制備促進(jìn)NK細(xì)胞增殖(體外培養(yǎng))的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007](2)⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞在制備促進(jìn)NK細(xì)胞有絲分裂的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0008](3)⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞在制備增強(qiáng)NK細(xì)胞抗凋亡能力的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0009]其中，(1)-(3)中，所述NK細(xì)胞均為離體的NK細(xì)胞。
[0010]進(jìn)一步，所述⑶3+⑶56+T細(xì)胞具體可為⑶3+⑶8+⑶56+Τ細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供一種促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的方法。
[0012]本發(fā)明所提供的促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的方法，具體可包括將⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟。
[0013]在所述方法的共培養(yǎng)體系中，所述CD3+CD56+T細(xì)胞與所述NK細(xì)胞的初始數(shù)量比可為1:1以上，如3:1以上，再如(3-4):1，具體如3:1。
[0014]進(jìn)一步，所述⑶3+⑶56+T細(xì)胞具體可為⑶3+⑶8+⑶56+Τ細(xì)胞。
[0015]在所述方法中，將所述CD3+CD56+T細(xì)胞與所述NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5%體積分?jǐn)?shù)的離體血漿的T551培養(yǎng)基(如日本寶日醫(yī)公司產(chǎn)品，貨號:GT-T551H2);所述離體血漿與所述NK細(xì)胞來源于同一物種。
[0016]所述物種具體可為人。
[0017]所述離體血漿與所述NK細(xì)胞最好來源于同一個體。
[0018]在所述方法中，所述共培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的初始濃度可為5X105/ml ;培養(yǎng)條件可為 37°C 5% C02。
[0019]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)⑶3+⑶56+T細(xì)胞(具體如⑶3+⑶8+⑶56+Τ細(xì)胞)具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明并且利用此特性將CD3+CD56+T細(xì)胞和NK細(xì)胞這兩類具有強(qiáng)大殺傷功能的免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)，建立了 NK細(xì)胞混合培養(yǎng)體系。本發(fā)明為NK細(xì)胞的體外大量增殖培養(yǎng)提供了新的思路。
【附圖說明】
[0020]圖1為⑶3+⑶56+T細(xì)胞促進(jìn)NK細(xì)胞增殖的功能亞群的鑒定結(jié)果。其中，*表示與NK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比差異極顯著(Ρ〈0.01)。
[0021]圖2為不同Τ/ΝΚ比例時(shí)NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。其中，*表示與NK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比差異極顯著(Ρ〈0.01)。
[0022]圖3為流式細(xì)胞法檢測兩種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞的細(xì)胞周期。單獨(dú)培養(yǎng)組中NK細(xì)胞處于DNA合成期的比例為46.4%，混合培養(yǎng)組中NK細(xì)胞處于DNA合成期的比例為61.1%(η = 3，組內(nèi)趨勢一致，選取典型結(jié)果展示)。
[0023]圖4為流式細(xì)胞法檢測兩種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞凋亡的凋亡比例?；旌吓囵B(yǎng)組中的NK細(xì)胞凋亡比例低于單獨(dú)培養(yǎng)組NK細(xì)胞，細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)(η = 3，組內(nèi)趨勢一致，選取典型結(jié)果展示)。
[0024]圖5為流式細(xì)胞法檢測兩種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞凋亡的凋亡比例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中，*表示與NK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組相比差異極顯著(Ρ〈0.01)。
[0025]圖6為兩種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞對人慢性粒細(xì)胞白血病系Κ562的殺傷率。
[0026]圖7為兩種培養(yǎng)方式下NK細(xì)胞對人胰腺癌細(xì)胞系JF-305的殺傷率。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029]人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株Κ562:為NK敏感細(xì)胞。記載于“王芳妹，楊子劍，韓梅等.阿司匹林對人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株Κ562的生長抑制作用.湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2013年05期”一文，公眾可以從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院獲得。
[0030]人胰腺癌細(xì)胞系JF305:為NK不敏感細(xì)胞。記載于“李昕，王宏，姜奕等.表達(dá)Ρ53基因的人胰腺癌細(xì)胞系JF305的建立.中華腫瘤雜志，1994年03期”一文，公眾可以從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院獲得。
[0031 ] 實(shí)施例1、⑶3+⑶56+Τ細(xì)胞對NK細(xì)胞增殖作用的初步研究
[0032]本實(shí)施例將初步研究⑶3+⑶56+T細(xì)胞對NK細(xì)胞增殖的影響。按照⑶4/CD8 分類法，可將 CD3+CD56+T 細(xì)胞分為 CD3+CD4+CD56+T 細(xì)胞、CD3+CD8+CD56+T 細(xì)胞和⑶3+⑶4⑶8⑶56+T細(xì)胞三群。由于⑶3+⑶4⑶8⑶56+Τ細(xì)胞在外周血所占比例非常低，本研究中暫不考慮。
[0033]一、外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離
[0034]按照如下方法獲得來自于同一個健康志愿者(經(jīng)臨床認(rèn)定無重大疾病的健康人)的外周血單個核細(xì)胞(PBMC):
[0035]采用人淋巴細(xì)胞分離液，利用密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。這是一種在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行的依密度而分離的離心法，各組分會依其密度分布在與其自身密度相同的液層中。人外周血中各種細(xì)胞密度不同，紅細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞為
1.092，淋巴細(xì)胞為1.074。根據(jù)各類血細(xì)胞密度的差異，采用密度介于兩種血細(xì)胞之間的細(xì)胞分離液對血液進(jìn)行離心，使一定密度的血細(xì)胞依照密度梯度分布于相應(yīng)的獨(dú)立帶，從而達(dá)到分離的目的。本次采用的淋巴細(xì)胞分離液密度為1.080。
[0036]1、健康志愿者晨起空腹于肘靜脈抽取25ml外周血，混合少量肝素抗凝留用；
[0037]2,50ml離心管中加入15ml淋巴細(xì)胞分離液，非常緩慢的將外周血加在淋巴細(xì)胞分離液之上；
[0038]3、離心管進(jìn)行密度梯度離心，2000rpm離心20分鐘，調(diào)整加速度于最低檔位，離心后分層由上至下分別為:血漿、PBMC、淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞；
[0039]4、吸取上層血漿，56°C水浴滅活30分鐘，離心取上清留用；
[0040]5、吸取PBMC，PBS充分混勻，100rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)三次；計(jì)數(shù)。
[0041]二、流式細(xì)胞分選
[0042]采用流式細(xì)胞分選方法從步驟一獲得的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中，分離如下五個細(xì)胞群:NK細(xì)胞(⑶3⑶5