二肽Pro-Asp在促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物生長和代謝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Pr0-Asp對動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1的促進(jìn)作用及其在動(dòng)物生長和代謝中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物生長受到生長軸(GHRH-GH-1GF-1)的調(diào)控，如何促進(jìn)肝臟IGF-1的分泌對于動(dòng)物生長和代謝具有重要的意義。研宄發(fā)現(xiàn)，日糧中不同營養(yǎng)物質(zhì)對肝臟IGF-1的分泌有重要的影響。日糧蛋白經(jīng)過消化后會(huì)形成一些含有2個(gè)氨基酸殘基的肽，稱為二肽。二肽不僅能為蛋白質(zhì)合成提高氮骨架，發(fā)揮其營養(yǎng)性作用，還可參與動(dòng)物的些生理活動(dòng)，如促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收利用、提高動(dòng)物機(jī)體的免疫能力和促進(jìn)瘤胃微生物的生長等，發(fā)揮其功能性作用，在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。除了活體層面研宄小肽功能外，小肽作為添加物處理細(xì)胞的試驗(yàn)也有報(bào)道。細(xì)胞培養(yǎng)基中添加肌肽和環(huán)二肽cyclo-[His-Pro] (CHP)均可以減緩缺血培養(yǎng)下PC12細(xì)胞的凋亡。
[0003]日糧經(jīng)小腸消化進(jìn)入腸道時(shí)，由于小腸的首過代謝作用和胞液中的肽水解酶分解作用，二肽進(jìn)入肝臟中的種類和濃度會(huì)有所改變，有報(bào)道(LIU et al.，2014)，二肽中連有脯氨酸(Pro)時(shí)，其穩(wěn)定性升高，可以以一定濃度在血液中存在。另有報(bào)道，肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能主要依賴于肝組織半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)活性的改變，抑制caspase_3能明顯減輕肝損傷。Caspase-3為天冬氨酸(Asp)特異性半胱氨酸蛋白酶，其活性與天冬氨酸的濃度有關(guān)。L-谷氨酰胺(Gln)作為DNA和谷胱甘肽等合成的氮前體，在肝組織再生，肝細(xì)胞增殖的過程中扮演著極其重要的角色。但是，目前有關(guān)二肽Pro-Asp對動(dòng)物肝細(xì)胞IGF-1分泌的影響尚未見研宄和報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供二肽Pro-Asp的一種新的生理功能，即二肽Pro-Asp (而非單體氨基酸Pro+Asp)能夠促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1。另外，Pro-Asp在促進(jìn)IGF-1分泌方面，具有類似生長激素(GH)的作用，因此可以應(yīng)用于動(dòng)物生長促進(jìn)劑。
[0005]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明公開了二肽Pro-Asp在促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1方面的應(yīng)用，主要包括以下方面:
二肽Pro-Asp在作為或制備動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0006]二肽Pro-Asp在作為或制備體外H印G2細(xì)胞或仔豬原代肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0007]二肽Pro-Asp在作為或制備體內(nèi)小鼠肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0008]二肽P1-Asp作為或制備!fepG2細(xì)胞或仔豬原代肝細(xì)胞IGF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0009]二肽Pro-Asp在作為或制備JAK2-STAT5信號(hào)通路激活劑方面的應(yīng)用，具體地，二肽P1-Asp是作為或制備小鼠肝臟細(xì)胞P-JAK2和P-STAT5蛋白表達(dá)促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。
[0010]二肽P1-Asp在作為或制備促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促進(jìn)劑方面的應(yīng)用，以及二肽Pro-Asp和生長激素GH聯(lián)用在作為或制備促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促進(jìn)劑方面的應(yīng)用；具體地，所述動(dòng)物肝細(xì)胞為HepG2細(xì)胞。
[0011]二肽Pro-Asp在作為或制備動(dòng)物生長促進(jìn)劑或飼料添加劑方面的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述動(dòng)物為豬。
[0012]本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，二肽Pro-Asp，而非Pro+Asp，能夠促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1。Pro-Asp不僅能夠在體外促進(jìn)H印G2細(xì)胞和仔豬原代肝細(xì)胞分泌IGF-1，還能夠在體內(nèi)促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞分泌IGF-1。另外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)二肽Pro-Asp在促進(jìn)IGF-1分泌方面，具有類似生長激素(GH)的作用，對于動(dòng)物生長有一定的促進(jìn)作用，因此，可用作動(dòng)物生長促進(jìn)劑或飼料添加劑使用。
[0013]本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明提供了 Pro-Asp的一種重要的新生理功能，首次公開了二肽Pro-Asp能夠在體外促進(jìn)H印G2細(xì)胞和仔豬原代肝細(xì)胞分泌IGF-1，同時(shí)能夠在體內(nèi)促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞分泌IGF-10
[0014](2)本發(fā)明提供了二肽P1-Asp在促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞IGF-1分泌方面，具有類似生長激素(GH)的作用，可用作動(dòng)物生長促進(jìn)劑，具有很好的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1為二肽Pro-Asp對H印G2細(xì)胞IGF-1分泌的影響。
[0016]圖2為二肽Pro-Asp對仔豬肝原代細(xì)胞IGF-1分泌的影響。
[0017]圖3為二肽Pro-Asp對H印G2細(xì)胞IGF-1 mRNA表達(dá)的影響。
[0018]圖4為二肽Pro-Asp對仔豬肝原代細(xì)胞IGF-1 mRNA表達(dá)的影響。
[0019]圖5為二肽Pro-Asp對H印G2細(xì)胞IGF-1 mRNA表達(dá)及蛋白的影響。
[0020]圖6為單體氨基酸Pro+Asp對H印G2細(xì)胞IGF-1 mRNA表達(dá)的影響。
[0021 ]圖7為二肽Pro-Asp對小鼠肝臟組織IGFs相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
[0022]圖8為二肽Pro-Asp與生長激素(GH)對IGF-1表達(dá)的作用比較。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0024]除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。
[0025]實(shí)施例1二肽Pro-Asp (而非氨基酸單體Pro+Asp)促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1 1、實(shí)驗(yàn)方法
(I)采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H印G2細(xì)胞，!fepato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)仔豬原代肝細(xì)胞。
[0026](2)分別用 Pro-Asp (50、200、500 μ M)和 Pro+Asp (500 μΜ)處理上述 H印G2 細(xì)胞和仔豬原代肝細(xì)胞24h。
[0027](3)收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白，分別利用qPCR和western blot方法檢測IGF-1mRNA和蛋白表達(dá)。
[0028]收集細(xì)胞上清，RIA或ELSIA方法檢測細(xì)胞上清中IGF-1分泌量。
[0029]2、結(jié)果如附圖1?6所示。結(jié)果表明，500 μ M的Pro-Asp可顯著提高H印G2細(xì)胞(圖1)和仔豬原代肝細(xì)胞(圖2)分泌IGF-1，同時(shí)顯著促進(jìn)!fepG2細(xì)胞(圖3)和仔豬原代肝細(xì)胞(圖4) IGF-1 mRNA的表達(dá)，顯著促進(jìn)H印G2細(xì)胞(圖5) IGF-1蛋白的表達(dá)。而單體氨基酸Pro+Asp則不具備Pro-Asp對肝細(xì)胞IGF-1分泌的促進(jìn)作用(圖6)。
[0030]實(shí)施例2尾靜脈注射二肽Pro-Asp對小鼠肝臟細(xì)胞IGF-1表達(dá)及信號(hào)通路的影響 1、實(shí)驗(yàn)方法
(I)動(dòng)物飼養(yǎng)條件只/箱，單養(yǎng)；飼養(yǎng)溫度與濕度:20?26 °C，40?70% ;采用10h:14 h晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。自由進(jìn)食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；檢疫:對購入SPF級(jí)C57BL BKS-DB小鼠預(yù)飼7 do期間每日檢查動(dòng)物一次。
[0031](2)動(dòng)物分組及處理:將4周齡大的小鼠隨機(jī)分為正常對照組、Tl組和T2組，每組6只，共3組。正常對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，Tl組小鼠尾靜脈注射純度95%的Pro-Asp 100 mg/kg，T2 組小鼠尾靜脈注射 Pro+Asp (45+51) mg/kg。小鼠處理 30 min 時(shí)開始采樣。
[0032](3)血液樣品的采集:將處理后的小鼠迅速摘掉眼球取血，用2 mL離心管收集血液，靜置待血液凝固后，3000 rpm/min離心15 min，收集血清，_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。血液中IGF-1含量采用試劑盒檢測，具體方法參見試劑說明書。
[0033](4)組織樣品的采集:試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，采血完畢后頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟、濾紙吸干，每只小鼠于固定位置剪一塊組織樣，放入2 mL離心管，迅速投入裝有液氮的容器中，采樣結(jié)束后轉(zhuǎn)移樣品至-80 °C冰箱中，保存?zhèn)溆?。組織樣品經(jīng)總蛋白提取后，采用Western Blot方法檢測IGF-1等相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)變化，綜合分析Pro-Asp對小鼠肝臟分泌IGF-1的影響。
[0034]2、結(jié)果如附圖7所示。由圖7可知，小鼠尾靜脈注射100 mg/kg Pro-Asp 30 min,Pro-Asp可以顯著上調(diào)小鼠肝臟組織IGF-1的表達(dá)，同時(shí)顯著提高P-JAK2和p_STAT5的蛋白表達(dá)，而單體氨基酸則無此促進(jìn)作用。結(jié)果提示Pro-Asp通過激活JAK2-STAT5信號(hào)通路促進(jìn)IGF-1蛋白的表達(dá)。
[0035]實(shí)施例3 Pro-Asp具有類似GH促進(jìn)IGF-1分泌的作用
1、采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H印G2細(xì)胞，分別用Pro-Asp(500 μ Μ)或/和GH (20 nM)處理細(xì)胞24h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，western blot方法分別進(jìn)行IGF-1蛋白和相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。
[0036]2、結(jié)果如附圖8所示。圖8表明，單獨(dú)添加GH和Pro-Asp均能夠顯著促進(jìn)JAK2和STAT5的磷酸化水平和IGF-1蛋白表達(dá)水平；與單獨(dú)添加GH和Pro-Asp相比，同時(shí)添加二者同時(shí)能夠顯著促進(jìn)JAK2和STAT5的磷酸化水平，但并不能顯著升高IGF-1蛋白表達(dá)水平，提示Pro-Asp具有類似GH的作用。
[0037]綜上所述，試驗(yàn)表明，二肽Pro-Asp (而非單體氨基酸Pro+Asp)能夠促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1，且在促進(jìn)IGF-1分泌方面，Pro-Asp具有類似生長激素(GH)的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.二肽Pro-Asp在作為或制備動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。2.二肽Pro-Asp在作為或制備體外H印G2細(xì)胞或仔豬原代肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。3.二肽Pro-Asp在作為或制備體內(nèi)小鼠肝細(xì)胞分泌IGF-1的分泌促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。4.二肽Pro-Asp作為或制備H印G2細(xì)胞或仔豬原代肝細(xì)胞IGF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。5.二肽Pro-Asp在作為或制備JAK2-STAT5信號(hào)通路激活劑方面的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，二肽Pro-Asp是作為或制備小鼠肝臟細(xì)胞P-JAK2和P-STAT5蛋白表達(dá)促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。7.二肽Pro-Asp在作為或制備促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。8.二肽P1-Asp和生長激素GH聯(lián)用在作為或制備促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促進(jìn)劑方面的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述應(yīng)用，其特征在于，所述動(dòng)物肝細(xì)胞為HepG2細(xì)胞。10.二肽Pro-Asp在作為或制備動(dòng)物生長促進(jìn)劑或飼料添加劑方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了二肽Pro-Asp在促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1方面的應(yīng)用。本發(fā)明公開的是二肽Pro-Asp，而非Pro+Asp，能夠促進(jìn)動(dòng)物肝細(xì)胞分泌IGF-1，Pro-Asp不僅能夠在體外促進(jìn)HepG2細(xì)胞和仔豬原代肝細(xì)胞分泌IGF-1，還能夠在體內(nèi)促進(jìn)小鼠肝細(xì)胞分泌IGF-1。另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)二肽Pro-Asp在促進(jìn)IGF-1分泌方面，具有類似生長激素（GH）的作用，對于動(dòng)物生長有一定的促進(jìn)作用，可用作動(dòng)物生長促進(jìn)劑或飼料添加劑。
【IPC分類】A61K38/05, C07K5/078, A61P5/06, A23K1/165
【公開號(hào)】CN104910254
【申請?zhí)枴緾N201510314607
【發(fā)明人】江青艷, 束剛, 王松波, 朱曉彤, 王麗娜, 高萍
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年6月10日