用于基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌的引物、snp標記及方法
【專利說明】用于基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌的引物、SNP標記及方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年11月26日提交的美國臨時專利申請No. 61/730,033的優(yōu)先 權(quán)，其公開的內(nèi)容通過引用全部并入本文。
【背景技術(shù)】
[000引 1.技術(shù)領域
[0004]本發(fā)明系關(guān)于檢測結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium化berculosis)，尤其是基因型 鑒定結(jié)核分枝桿菌（M.化berculosis)，之引物、SNP標記及方法。
[0005] 2.相關(guān)領域的描述
[0006] 結(jié)核?。═B)為全球性的健康議題。世界衛(wèi)生組織（WK))已確認結(jié)核病為流行病 之一，并評估全球約=分之一的人口曾被結(jié)核分枝桿菌（MTB)所感染。流行病學研究已證 實，不同基因型之結(jié)核分枝桿菌（MTB)可能于不同地區(qū)盛行，且基因型分布系與人口遷移 相關(guān)。MTB基因組多樣性是否會影響人類疾病之臨床狀況仍未有定論。
[0007]MTB菌株冊7Rv之完整基因組已于1988年公開，其長度約4Mb，并包含約4000個 基因。MTB可被分類為6個主要菌株及15個次要菌株?；蚪M變異影響MTB之傳播、毒性、 抗微生物劑抗性及其它屬性，因此，用W區(qū)分不同MTB分離株之分子技術(shù)之發(fā)展亦為流行 病學之重要關(guān)注焦點。
[0008] 已發(fā)展出聚焦于產(chǎn)生系統(tǒng)發(fā)生信息數(shù)據(jù)之基因型鑒定方法，W研究不同來 源之多個臨床樣品。近來，常使用兩種基因型鑒定方法進行結(jié)核病傳播之研究（van DeutekomH.etal.，JClinMicrobiol2005, 43 (9): 4473-4479)。間格區(qū)寡核巧酸分型 (spoligotyping)系基于直接重復值R)基因座之多態(tài)性，所述基因座由W非重復性間隔 序列分開之36-bp之DR拷貝所組成。其為WPCR為基礎之反向雜交技術(shù)進行MTB基因型 鑒定。攜帶式數(shù)據(jù)格式可使實驗室之間之比對更易于進行。到公開時日，基于間格區(qū)寡 核巧酸分型特征匹配建立了可免費取得的菌株品系鑒定之數(shù)據(jù)庫炬rudeyKetal.，BMC Microbiol2006,6:23)。另一種用于MTB菌株分型之分子技術(shù)則W分枝桿菌散置重復單 元（MIRU)之不同數(shù)量縱列重復（VNTR)為基礎（MazarsE.etal.，Proc化tlAcadSci USA2001，98 (4): 1901-1906;ComasLetal.'PLoSOne2009, 4(11):e7815;SupplyI\et al.，MolMicrobiol2000, 36 (3): 762-771)。此方法系基于在所選的 12、15 或 24 個MIRU 基因座的每個中所觀察到的重復之數(shù)目，所述重復之數(shù)目使用WPCR為基礎之方法確定。
[0009] 然而，用于基因型鑒定MTB的常規(guī)方法仍有缺點，包含DNA樣品需求量大、耗時、敏 感性及特異性不足、無法對特定菌株進行基因分型。因此，仍須改善基因型鑒定MTB之方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本申請描述用于基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌之引物組，其選自引物組1至25之一。
[0011] 本申請?zhí)峁┯糜诨蛐丸b定結(jié)核分枝桿菌之延伸引物，其選自SEQIDNo. 51至75 之一。
[0012] 本申請?zhí)峁┙Y(jié)核分枝桿菌之單核巧酸多態(tài)性標記之組合，所述標記選自SEQID No. 76 之位置 301 之"T"、SEQIDNo. 77 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 78 之位置 301 之 "A"、SEQIDNo. 79 之位置 301 之"G"、SEQIDNo. 80 之位置 301 之"G"、SEQIDNo. 81 之 位置 301 之"G"、SEQIDNo. 82 之位置 301 之"C"、SEQIDNo. 83 之位置 301 之"G"、SEQ IDNo. 84 之位置 301 之"C"、SEQIDNo. 85 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 86 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 87 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 88 之位置 301 之"G"、SEQIDNo. 89 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 90 之位置 301 之"G"、SEQIDNo. 91 之位置 301 之"G"、SEQ IDNo. 92 之位置 301 之"A"、SEQIDNo. 93 之位置 301 之"C"、SEQIDNo. 94 之位置 301 之"C"、SEQIDNo. 95 之位置 301 之"T"、SEQIDNo. 96 之位置 301 之"T"、SEQIDNo. 97 之位置 301 之"T"、SEQIDNo. 98 之位置 301 之"T"、SEQIDNo. 99 之位置 301 之"T"W及 SEQIDNo. 100 之位置 301 之"C"。
[0013] 本申請亦提供一種基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌方法，包括取得樣品；使用選自引物 組1至25(SEQIDNo. 1至50)之一種或多種引物組進行擴增，并獲得至少一種第一DNA片 段；使用所得第一DNA片段作為模板，并使用選自SEQIDNo. 51至75之一種或多種延伸引 物進行擴增，并獲得至少一種第二DNA片段；W及，使用質(zhì)譜檢測該第二DNA片段。
[0014] 于其它實施例中，本申請亦提供一種用于基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌之試劑盒，包 括選自由引物組1至25(SEQIDNo. 1至50)所成群組之至少一引物組，及選自由SEQID No. 51至75所成群組之至少一延伸引物。
【附圖說明】
[001引 圖1系選擇品系特異性DNA標記之整體流程圖。
[0016] 圖2顯示MTB基因組中SNP標記之連鎖不平衡。該LD圖系WHaploview軟件所 制作，且圖上之顏色碼系依循Haploview之標準顏色表，藍色表示|D'I= 1且L0D<2,鮮紅 色表示ID'I= 1且L0D> 2。
[0017] 圖3顯示使用菌株特異性SNP標記之MTB分離株之系統(tǒng)發(fā)生分析。藉由 軟件使用110-SNP數(shù)據(jù)（A)與25-ta拆NP數(shù)據(jù)炬）W計算根井距離，然后W鄰接法構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)生樹。圖3亦顯示MTB染色體上之分類的SNP位置；110-SNP(C)及25-ta拆NP值）。
[0018] 圖4顯示用于菌株分類之特異性標記鑒定。藉由組合間格區(qū)寡核巧酸分型及SNP 基因型鑒定數(shù)據(jù)，表征了 51個現(xiàn)代北京、25個荷蘭、11個EAI、10個古代北京、7個T及3個 LAM分離株之110個SNP之等位基因之頻率。
[0019] 圖5顯示W(wǎng)四種品系特異性SNP標記為基礎之決定樹。32個品系特異性SNP中 的4個具有100%之變異等位基因之頻率，用于將81個臨床分離株分類為古代北京炬a)、 現(xiàn)代北京炬m)、東非-印度（EAI)及拉了美洲和地中海（LAM)品系。
[0020] 圖6顯示歐美品系內(nèi)之高基因多態(tài)性。（A)使用4, 419個全基因組SNP標記之歐 美菌株之系統(tǒng)發(fā)生分析，W化ylip軟件（鄰接法）計算根井距離而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。炬） 歐美菌株之主成分分析（PCA)，將4, 419個全基因組SNP標記之基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)值，接 著WPCA法使用SAS程序分析該14個歐美臨床分離株及H37RV參考菌株。
[0021] 圖7顯示W(wǎng)156個結(jié)核分枝桿菌分離株之24-MIRU-VNTR基因型鑒定為基礎之最 小生成樹。圓圈代表通過24-MIRU-VNTR基因型鑒定進行分類之不同類型，且依據(jù)間格區(qū)寡 核巧酸分型之分類上色。圓圈尺寸代表特定基因型之分離株之數(shù)目表示無法W間格 區(qū)寡核巧酸分類者）。
[002引圖8顯示歐美品系之新的假設性亞型定義，使用4, 419個全基因組SNP標記之歐 美菌株之系統(tǒng)發(fā)生分析，W化ylip軟件（鄰接法）基于根井距離而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。
[002引圖9顯示新的假設性歐美亞型中之高度基因純合性。14個歐美菌株（7個化arlem及7個T株）W454或化Seq2000測序儀進行全基因組測序，基于系統(tǒng)發(fā)生樹（圖8)，該等 菌株有兩個主要簇（分別為6個EuAml亞型及7個EuAm2亞型）。81個EuAml-特異性之 SNP及133個EuAm2-特異性之SNP的變體等位基因頻率=100%。
[0024] 圖10顯示具有多重反應井方案的25個ta拆NP之PCR引物、延伸引物、位置及對 應之等位基因。
[0025] 圖11顯示本申請與常規(guī)基因型鑒定方法之比較。
[002引發(fā)明詳述
[0027] 于本申請中，用于基因型鑒定結(jié)核分枝桿菌之引物組選自引物組1-25,各引物組 系含有正向引物與反向引物。引物組1-25如下所示：
[0028] 引物組 1;ACGTTGGATGTTCTGGACGACCTGTCCTAC(沈QIDNo. 1)及ACGTTGGATGAGCTG CGCCAAGGTTCGTG(SEQIDNo. 2)；
[0029] 引物組 2;ACGTTGGATGTTGTAGCTGCCCAAATTGCC(沈QIDNo. 3)及ACGTTGGATGGGCTT CAATCTCGGCTTGG(SEQIDNo. 4)；
[0030] 引物組 3;ACGTTGGATGTATTCAACACCGGCATCGGG(SEQIDNo. 5)及ACGTTGGATGTCGCC TGGTCGTGGAAGAAC(沈QIDNo. 6);
[0031] 引物組 4;ACGTTGGATGATCGGACAGCAGAAGGCAC(沈QIDNo. 7)及ACGTTGGATGACTCCC GCGGAACGTGGTG(SEQIDNo. 8)；
[0032] 引物組 5;ACGTTGGATGCAACACCGGCAACTTCAAC(沈QIDNo. 9)及ACGTTGGATGAATTAG CGTCTCCTCCGTTG(沈QIDNo. 10);
[0033] 引物組 6 ;ACGTTGGATGTCGAACCCGCCGACAAATG(SEQIDNo. 11)及ACGTTGGATGTCGAT TGGTCGCATGCACTG(沈QIDNo. 12);
[0034] 引物組 7;ACGTTGGATGAAACCTCGGCATAGGGATCG(SEQIDNo. 13) ACGTTGGATGTCGACAGGACTATTGGTAGC及（SEQIDNo. 14);
[00巧]引物組 8 ;ACGTTGGATGAAGACGACGGGCCGGATATG(SEQIDNo. 15)及ACGTTGGATGCGTC AAGAGCTTCCCAAATC(SEQIDNo. 16)；
[0036] 引物組 9;ACGTTGGATGCATCCGGGAACACCGTAAAC(沈QIDNo. 17)及ACGTTGGATGATCA CCTTCTTATCGGGTGG(SEQIDNo. 18)；
[0037] 引物組 10;ACGTTGGATGCCTGGATTTCAGATATTGCC(沈QIDNo. 19)及ACGTTGGATGTGG CCAGCCCTAGCAAGTC(SEQIDNo. 20)；
[0038] 引物組 11;ACGTTGGATGAGAACAAACGCGGGATTCAC(沈QIDNo. 21)及ACGTTGGATGTCT CCCGGAGATCACCATTC(沈QIDNo. 22);
[0039] 引物組 12 ;ACGTTGGATGGTTGTTTTTGGCCGGGCAG(SEQIDNo. 23)及ACGTTGGATGATCG AGCAGACTCAGCGCTT(沈QIDNo. 24);
[0040] 引物組 13;ACGTTGGATGTGCTACCGCCAATGTTCAAC(沈QIDNo. 25)及ACGTTGGAT