As-str基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測人體基因組中具有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，尤其涉及連鎖的AS-STR 基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 親緣鑒定是法醫(yī)學(xué)鑒定上的難點。無名人員身份識別、失散人員認(rèn)親、意外或交通 事故死亡人員認(rèn)領(lǐng)，甚至是大災(zāi)難性事件受害人的身源鑒定都會涉及親緣鑒定。對于一些 沒有父母參與的親緣鑒定來說，除了 Y染色體和線粒體DNA遺傳標(biāo)記可以排除父系或母系 親緣關(guān)系之外，應(yīng)用常染色體上非連鎖的遺傳標(biāo)記時，由于被鑒定的個體之間無法直接觀 察等位基因的遺傳情況，也就無法直接排除親緣關(guān)系，只能通過比較親屬與無關(guān)個體共有 等位基因的概率來評估親緣關(guān)系。由于STR的遺傳背景，表現(xiàn)為很多STR的等位基因頻率 大于0. 125或更高的0. 25,此值大于三級親屬具有12. 5%或二級親屬有25%相同等位基因 的值，因而無法區(qū)分三級親緣關(guān)系或無關(guān)個體關(guān)系，親緣關(guān)系在二級或三級親屬的鑒定上 遇上了瓶頸。顯然，用常染色體非連鎖的STR只是對一級親屬（全同胞）鑒定有較好的效 果，而無法將二級親屬、三級親屬或是無關(guān)個體區(qū)分開，故無法進(jìn)行親緣關(guān)系鑒別。
[0003] 人類基因組中，存在著一類緊密連鎖的STR基因座，連鎖的STR構(gòu)成單體型 (haplotye)從親代遺傳給后代，緊密連鎖STR單體型具有高度多態(tài)性。在無關(guān)個體之間具 有相同單體型的概率非常小，可克服常規(guī)非連鎖STR多態(tài)性不高和遺傳背景的干擾，突破 目前不能鑒定二級以上親緣關(guān)系和區(qū)別不同親緣關(guān)系的難題。如果某緊密連鎖STR組單體 型的多態(tài)性是無限地高，那么無關(guān)個體之間具有相同單體型的概率就會非常非常小，只有 具有親緣關(guān)系的個體才會有相同的單體型，這樣就能將有親緣關(guān)系和沒有親緣關(guān)系的個體 區(qū)分開來。
[0004] 然而，除X染色體STR基因座外，現(xiàn)有的應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)鑒定的STR都不是緊密連鎖 的STR，能夠應(yīng)用于實際親緣鑒定的緊密連鎖STR復(fù)合擴增體系迄今國內(nèi)外仍未有報道。因 此，本發(fā)明從3號、4號、17號常染色體上篩選出有高度多態(tài)性的緊密連鎖STR基因座，建 立復(fù)合擴增體系。本發(fā)明開發(fā)的緊密連鎖STR復(fù)合擴增試劑盒不僅僅適用于親緣鑒定，還 可以用于染色體異常的產(chǎn)前診斷，市場應(yīng)用前景廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于中國人群的，可以快速、 方便針對非緊密連鎖的常染色體STR、Y-STR、X-STR無法將二級親屬、三級親屬或是無關(guān)個 體區(qū)分開，故無法進(jìn)行親緣關(guān)系鑒別進(jìn)行鑒定的AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系及 應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的：
[0007] AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系，該復(fù)合擴增體系共包含15個基因座：D3S 2402, D3S2452, D3S1766, D3S4554, D3S2388, D3S4551、D3S2422、D3S3051, D3S3053, D4S2364, D4S2404，AC001348A，AC001348B，D17S975 和 D17S1294 ;所述 15 個基因座引物分別用 FAM、 HEX、TAM 或 ROX 四種熒光素標(biāo)記；FAM 熒光素標(biāo)記 D17S1294、D3S4551、D4S2404 和 D3S3053， HEX 熒光素標(biāo)記 AC001348B、AC001348A、D3S2422 和 D3S4554, TAMRA 熒光素標(biāo)記 D3S2388、 D3S2452、D3S1766 和 D17S975, ROX 熒光素標(biāo)記 D4S2364、D3S3051 和 D3S2402 ;其中擴增引 物對分別為：
[0008] D3S2402 引物對：
[0009] F:CCTGGGCAACATAATGAGAT，
[0010] R:TGGACAAAGCATTTTATAATCTG ;
[0011] D3S2452 引物對：
[0012] F:GCTTGCAGATAGCAGATCGT，
[0013] R:TATAAGATTAGTCAGGGCTCGC ;
[0014] D3S1766 引物對：
[0015] F:ACCACATGAGCCAATTCTGT,
[0016] R:ACCCAATTATGGTGTTGTTACC ;
[0017] D3S4554 引物對：
[0018] F:CAATACGGGCTGATGATAGG,
[0019] R:TGGAAATGCTCCCATAGATT ;
[0020] D3S2388 引物對：
[0021] F:TCCACTCAGTACAAGTCTGGG,
[0022] R:GATCCTGTGGTTTGTCGATC ;
[0023] D3S4551 引物對：
[0024] F:AGTCATTGTCAGGCATTGGT，
[0025] RiATATGACCTTGGGCAACAAA ；
[0026] D3S2422 引物對：
[0027] F:ACTGAGAAAGTCTTTCTGTGCC,
[0028] R:GTTCACCATCTACAGTGGGC ;
[0029] D3S3051 引物對：
[0030] F:GGCAATTAGTTATGTAGCAATCG，
[0031] R:TGAGTCAATTGTGCTGGCTA ;
[0032] D3S3053 引物對：
[0033] F:TCTTTGCTCTCATGAATAGATCAGT,
[0034] R: GTTTGTGATAATGAACCCACTCAG ;D4S2364 引物對：
[0035] F:AACAAAACTAGGAGATCATGTGG，
[0036] RiACCTTGACTTTGATGTGGGA ；
[0037] D4S2404 引物對：
[0038] F:ATATATATGATGCATGTCAAAATGG，
[0039] R:CTGGGCAAACTCATTTCAAC ;
[0040] ACOOlM8A 引物對：
[0041] F:CAACCATCAGTGATTTGATGGTTTA，
[0042] RiCTGTTCTTCTTAATCCTTAACCAGT ；
[0043] AC001348B 引物對：
[0044] F:TCTCAGTCCTGATTTCTTGATTTTG，
[0045] R:CCAGAGCTAACACCACATTCA ;
[0046] D17S975 引物對：
[0047] F:AGTAATGGGACTTCTCGGCT，
[0048] RiTAGGATCCCAAGTGTGCAGT ；
[0049] D17S1294 引物對：
[0050] F:TGGCATGCAATTGTAGTCTC，
[0051] R:TTCTTTCCTTACTAAGTTGAGAACG ;
[0052] 在上述AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系中，所述15個AS-STR基因 座組建 7 個連鎖群，分別是：I :D3S2402-D3S2452-D3S1766 ; II :D3S4554-D3S2388 ; III ：D3S4551-D3S2422 ； IV ：D3S305 1-D3S3053 ； V ：D4S2364-D4S2404 ； VI ： AC001348A-AC001348B;VE :D17S975-D17S1294。
[0053] 上述AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系在制備認(rèn)定親緣關(guān)系檢案試劑中的應(yīng) 用。
[0054] 上述AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系在制備對常染色體相關(guān)性遺傳病進(jìn)行 產(chǎn)前診斷的檢測試劑中的應(yīng)用。
[0055] -種試劑盒，包括上述的AS-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增體系中的擴增引物對 的混合物。
[0056] -、本發(fā)明復(fù)合擴增體系中15個基因座的選擇
[0057] (1)緊密連鎖：
[0058] 從基因組中篩選位于同一染色體上緊密連鎖STR基因座，緊密連鎖STR組成的連 鎖對或連鎖組（linkage group)按單體型穩(wěn)定遺傳，每個連鎖組內(nèi)的STR基因座遺傳距離 <3cM。根據(jù)文獻(xiàn)（Inturri S，et al. Forensic Sci IntGenet. 2011 ;5:152-4)的標(biāo)準(zhǔn)，遺 傳距離< 3cM可以認(rèn)為呈緊密連鎖。不同STR連鎖組位于不同的染色體上，或者多個連鎖 組雖在同一染色體上但相距很遠(yuǎn)，可以自由重組，應(yīng)用多個連鎖組的STR基因座構(gòu)建復(fù)合 擴增體系。應(yīng)用這些體系檢測樣本進(jìn)行親緣推斷時，既考慮聯(lián)合應(yīng)用連鎖基因座（一個連 鎖組可看作是一個基因座）來提高遺傳標(biāo)記的多態(tài)性；又考慮連鎖STR組與組之間的自由 重組，使組與組之間能夠應(yīng)乘積規(guī)則（product rule)進(jìn)行法醫(yī)遺傳學(xué)的統(tǒng)計。
[0059] 本發(fā)明的15個基因座分布于3號、4號和17號染色體上緊密連鎖的， 15 個 AS-STR 基因座可以組建7 個連鎖群（I :D3S2402-D3S2452-D3S1766 ; II : D3S4554-D3S2388 ； III：D3S4551-D3S2422 ； IV ：D3S3051-D3S3053 ； V ： D4S2364-D4S2404 ； VI :AC001348A-AC001348B ;W :D17S975-D17S1294)。緊密連鎖的基因座構(gòu)成單倍型，在親 緣鑒定中有利于分析親代與子代之間的遺傳關(guān)系。
[0060] (2)易于擴增：
[0061] 除上述15個基因座外，實驗初期發(fā)明人還選擇了另外一些位于3號染色體上的 基因座，如D3S1764、D3S2435等連鎖的基因座；4號染色體上的基因座D4S3334、D4S1644、 D4S2426、D4S2368、D4S2414等連鎖的基因座。但單基因座擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因座的 擴增存在著一些問題，有的擴增的產(chǎn)物量少，顯帶過淺，甚至有時很難得到擴增產(chǎn)物，如 D4S2368 ;有的很容易出現(xiàn)非特異帶（如影子帶），如D4S2414 ;而上述15個基因座易于擴增 穩(wěn)定性好，結(jié)果清晰，非特異性帶很少。
[0062] 因此最后選擇了 D3S2402，D3S2452，D3S1766，D3S4554，D3S2388，D3S4551、 D3S2422、D3S3051,D3S30