一種快速檢測奶源動物以及原料乳中金黃色葡萄球菌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測奶源動物以及原料乳中金黃色葡萄球菌的試劑盒及其檢測 方法，屬于微生物檢測技術(shù)，適用于奶源動物金黃色葡萄球菌感染以及原料乳中金黃色葡 萄球菌污染的定性檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱SA)，也稱"金葡菌"，是一種革蘭 氏染色陽性球菌，直徑〇. 8 μ m，在顯微鏡下排列成葡萄串狀。金葡菌在自然界中無處不在， 空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可以找到，是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌之 一，且在國家鮮乳標(biāo)準(zhǔn)中列為不得檢出的項目。并且金葡菌也是引起慢性/隱性奶牛乳房 炎的主要病原菌之一，可以極大的影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，給奶制品產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。因此檢測牛奶中的金葡菌不僅是保證食品安全的需要，同時也可以應(yīng)用于監(jiān)測奶牛 的健康程度，從根本上提高奶牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 金葡菌在宿主體內(nèi)的生存以及其主要毒力與多種金屬離子的攝取緊密相關(guān)，這 一過程是通過特定的基因所編碼的特定的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實現(xiàn)的。因此只要檢測這 些特定的基因便可快速檢測金葡菌。Anderson，A. S等（Anderson，Scully，Timofeyeva， Murphy，McNeil，Mininni，Nunez，Carriere，Singer，Dilts and Jansen, Staphylococcus aureus manganese transport protein C is a highly conserved cell surface protein that elicits protective immunity against S. aureus and Staphylococcus epidermidis. 205. 1688-96)的研宄證明猛離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 C(Mn transporter protein C， MntC)是錳離子轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的一個重要組成成分，它存在于金葡菌的膜表面，在感染宿主的 早期以及定居、生長和大量繁殖階段都會表達(dá)的蛋白，并高度保守。本實驗室的研宄涉及到 從不同地區(qū)患有臨床型或者隱型乳房炎的奶牛所產(chǎn)的牛奶里分離金葡菌，并通過檢測這些 菌株，證明mntc基因廣泛存在于這些不同基因型、血清型的金葡菌菌株中，且高度保守。
[0004] 在檢測牛奶中所含金葡菌的方法上，目前國內(nèi)外主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等 標(biāo)準(zhǔn)對金葡菌進(jìn)行檢測，整個過程一般需要3-5天，且操作復(fù)雜，已經(jīng)不能滿足微生物快速 準(zhǔn)確檢測的現(xiàn)實需要。因此，迫切需要建立新的快速檢測技術(shù)和方法。
[0005] 近年來，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法的發(fā)展和應(yīng)用，使金葡菌的快速檢測有了很 大發(fā)展。但是，免疫學(xué)方法如ELISA、膠體金等，在成本、敏感性等方面尚不理想，而分子生物 學(xué)檢測，如PCR、分子探針等，操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)，已經(jīng)被越來越多的應(yīng)用。現(xiàn)在 市場上大多數(shù)檢測金葡菌的PCR或者分子探針方法所采用的引物一般是根據(jù)耐熱核酸酶 (nuc)基因、細(xì)菌16S rRNA或者23S rRNA基因設(shè)計的，而這些檢測方法并不能直接反映所 檢測出的金葡菌的毒力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于建立一種從牛奶中直接分離病原微生物的快捷方法，再結(jié)合使 用針對mntc基因設(shè)計的特異性引物，通過PCR方法檢測mntc基因，從而達(dá)到快速檢測牛奶 中是否存在金葡菌的目的。
[0007] 本發(fā)明還進(jìn)一步提供了利用該檢測方法在制備從牛奶中檢測金葡菌的檢測試劑 盒的應(yīng)用，該試劑盒可用于奶源動物以及原料乳中金葡菌的檢測，檢測方法簡便快捷，適 用于工業(yè)化需要。該試劑盒包括：（1)牛奶中微生物的提取試劑：Pecoll溶液1，密度為 1.05(^/1^屮此〇11溶液2，密度為1.1238/1^;恥(：1溶液，濃度為0.15厘；（2)?0?檢測試劑 ： 10XPCR緩沖液，dNTP，Taq DNA聚合酶，CldH2O以及3對mntc基因的引物；（3)陽性對照：金 葡菌基因組DNA ; (4)陰性對照：大腸桿菌基因組DNA ; (5)空白質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品：ddH20。其中：
[0008] 3對引物是根據(jù)金葡菌的mntc基因設(shè)計的，所述mntc基因序列如SEQ ID NO. 1所 示。引物序列如下：
[0009] 第一對引物：
[0010] Fl :5' -AAATTAAAAGTAGTAACGACG-3'（SEQ ID NO. 2)
[0011] Rl :5' -TTATTTCATGCTTCCGTGTAC-3'（SEQ ID NO. 3)
[0012] 第二對引物：
[0013] F2 :5, -AGACTGGTAACGGTTGGT-3,（SEQ ID NO. 4)
[0014] R2 :5' -GCACCTTCACTTGTAATCAT-3'（SEQ ID NO. 5)
[0015] 第三對引物：
[0016] F3 :5' -CATGTGGTACTGGTGGTAA-3'（SEQ ID NO. 6)
[0017] R3 :5' -ATGCGTGTGGATCTTGTT-3'（SEQ ID NO. 7)
[0018] 陽性對照是采用本實驗室用國標(biāo)法分離鑒定的金黃色葡萄球菌株中提取的基因 組 DNA。
[0019] 陰性對照是采用本實驗室從BL21大腸桿菌株中提取的基因組DNA。
[0020] 本發(fā)明所提供的具體檢測方法：
[0021] (1)提取牛奶中的微生物：
[0022] 1)取待檢牛奶樣品與Percoll溶液1按0· 5~I : 1的體積比混勾，室溫4, 500g 離心15min，棄去上層懸浮物；
[0023] 2)配制Pecoll梯度溶液：按I : 1的體積比將Percoll溶液1緩慢加到Percoll 溶液2上層，注意不要沖動下層梯度；
[0024] 3)將步驟1)中所得物緩緩加入到步驟2)中準(zhǔn)備好的Percoll梯度溶液的表面 上，室溫14, OOOg離心5min，小心收集上層乳白色溶液；
[0025] 4)將步驟（3)中的所得物按0. 3~0. 5 : 1的體積比加入至NaCl溶液中，混勻后 室溫15, OOOg離心5min，棄上清液；
[0026] 5)沉淀用適量CldH2O洗滌，室溫13, OOOg離心5min，棄上清液；
[0027] 6)用所提牛奶樣品1/50體積的CldH2O重選沉淀，獲得奶樣中微生物的濃縮液，作 為DNA模板。
[0028] (2)PCR法擴(kuò)增待檢樣本中的mntc基因，具體步驟如下：
[0029] 1)按照以下比例制備反應(yīng)體系：
[0030] CldH2O 8. 2 μ L
[0031] 10 X PCR 緩沖液 2· 5 μ L
[0032] 上游引物（F1，F(xiàn)2 或 F3) (10μΜ) IyL
[0033] 對應(yīng)的下游引物（R1，R2或R3) (ΙΟμΜ) IyL
[0034] dNTP 2 μ L
[0035] Taq DNA 聚合酶 0· 3 μ L
[0036] DNA 模板 IOyL
[0037] 2) PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下：
[0038] 預(yù)變性：95°C 5min ;
[0039] 30 個循環(huán)：95°C 45s ;55°C 45s ;72°C Imin ;
[0040] 延伸：72°C 15min。
[0041] PCR反應(yīng)產(chǎn)物將用于電泳檢測鑒定，也可以保存于4°C。
[0042] (3)電泳檢測鑒定
[0043] 將步驟（2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，在凝膠成像儀中觀 察結(jié)果并拍照，如果檢測到期待大小的特異性條帶：如應(yīng)用第一對引物得到837bp條帶，應(yīng) 用第二對引物得到346bp條帶，或應(yīng)用第三對引物得到375bp條帶則證明所檢樣品中存在 金葡菌。
[0044] 應(yīng)用本發(fā)明的從牛奶中快速提取并檢測金葡菌的方法所制備的試劑盒，可以快速 準(zhǔn)確的檢測牛奶中是否存在金葡菌，檢測方法簡便快速、特異性和靈敏度高。整個檢測過程 在同一天可以完成，與常規(guī)培養(yǎng)檢測法相比大大提高了檢測效率。
【附圖說明】
[0045] 圖1應(yīng)用3對mntc基因特異性引物PCR擴(kuò)增DNA片段檢測結(jié)果，其中金葡菌 DNA模板采用按國標(biāo)法分離鑒定，來自內(nèi)蒙古奶樣中分離的金葡菌NM006的菌液（濃度為 lX103CFU/10yL) :l)Marker DL2000,2)是應(yīng)用第二對引物F2和R2擴(kuò)增金葡菌，3)是應(yīng) 用第三對引物F3和R3擴(kuò)增金葡菌，4)是應(yīng)用第一對引物Fl和Rl擴(kuò)增金葡菌，5)是應(yīng)用 第二對引物F2和R2擴(kuò)增ddH 20,6)是應(yīng)用第三對引物F3和R3擴(kuò)增ddH20,7)是應(yīng)用第一 對引物Fl和Rl擴(kuò)增ddH 20。
[0046] 圖2牛奶樣品檢測結(jié)果圖：標(biāo)準(zhǔn)金葡菌1株以及按國標(biāo)法分離鑒定的16株金葡菌 按I X 104CFU/0. 5mL人工污染無菌鮮牛奶利用第一對引物Fl和Rl檢測的檢測結(jié)果，包括 圖2-1和圖2-2,其中：
[0047] 圖2-1 :l)Marker DL2000,2)是金葡菌基因組DNA，3)是內(nèi)蒙古奶樣中分離的金葡 菌NM006,4)是內(nèi)蒙古奶樣中分離的金葡菌NM005,5)是黑龍江奶樣中分離的金葡菌HJ31， 6)是河北奶樣中分離的金葡菌HB31，7)是河北奶樣中分離的金葡菌HB0823-2,8)是河北奶 樣中分離的金葡菌HB49-3,9)是甘肅奶樣中分離的金葡菌GS22，10)是甘肅奶樣中分離的 金葡菌GS38，11)是購買的標(biāo)準(zhǔn)金葡菌ATCC29213，12)是無菌鮮牛奶，13)是大腸桿菌基因 組 DNA，14) CldH2O。
[0048] 圖2-2 : DMarker DL2000, 2)是金葡菌基因組DNA，3)是浙江奶樣中分離的金葡菌 Zh_QS13,4)是浙江奶樣中分離的金葡菌Zh_HZ041，5)是重慶奶樣中分離的金葡菌CQ339， 6)是新疆奶樣中分離的金葡菌XJ041，7)是新疆奶樣中分離的金葡菌XJ048,8)是上海奶樣 中分離的金葡菌SH008,9)是上海奶樣中分離的金葡菌SH004，10)是無菌鮮牛奶，11)是大 腸桿菌基因組DNA，12) ddH20。
[0049] 圖3試劑盒特異性鑒定圖：按國標(biāo)法分離鑒定的7株非金葡菌和金葡菌分別按 I X IO3CFUA). 5mL人工污染無菌鮮牛奶利用第一對引物Fl和Rl檢測的檢測結(jié)果，其中： 1)是ddH20, 2)是大腸桿菌基因組DNA，3)是無菌鮮牛奶，4)是河北奶樣中分離的非金葡菌 NSA_HB47,5)是非金葡菌NSA_HB47和金黃色葡萄球NM006菌混合，6)是河北奶樣中分離的 非金葡菌NSA_HB241，7)是非金葡菌NSA_HB241和金葡菌NM006混合，8)是北京奶樣中分離 的非金葡菌NSA_FM36,9)是非金葡菌NSA_FM36和金葡菌NM006混合，10)是黑龍江奶樣中 分離的非金葡菌NSA_2K108，11)是非金葡菌NSA_2K108和金葡菌NM006混合，12)是黑龍江 奶樣中分離的非金葡菌NSA_HJ56,13)是非金葡菌NSA_HJ56和金葡菌NM006混合，14)是 陜西奶樣中分離的非金葡菌NSA_5121455,15)是非金葡菌NSA_5121455和金葡菌NM006混 合，16)是甘肅奶樣中分離的非金葡菌NSA_QD22，17)是非金葡菌NSA_QD22和金葡菌NM006 混合，18)是 Marker DL2000。
[0050] 圖4試劑盒敏感度鑒定圖：按國標(biāo)法分離鑒定的1株金葡菌分別 按 I X 102CFU/0. 5mL，I X 103CFU/0. 5mL，I X 104CFU/0. 5mL，I X 105CFU/0. 5mL 和 I X 106CFU/0. 5mL濃度人工污染無菌鮮牛奶，利用第一對引物Fl和Rl檢測的結(jié)果： 1)是 Marker DL2000, 2)是金葡菌菌液（I X 103CFU/10 μ L)，3)是用金葡菌 NM