基于熒光定量pcr熔解曲線法的dhav分型檢測法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的DHAV(甲型鴨肝炎病毒）分型檢 測法。
【背景技術】
[0002] 甲型鴨肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV)是一種引起雛鴨病毒性肝 炎的主要病原。其主要以1~21日齡的雛鴨發(fā)生急性壞死性肝炎為病理特征，發(fā)病迅速 且死亡率高并具有高度的傳染性，目前已呈世界性分布。DHAV根據遺傳進化距離可分為 DHAV-A，DHAV-B，DHAV-C共三種基因型，其中我國的優(yōu)勢毒株主要是DHAV-A和DHAV-C。由 于針對的DHAV特異性抗體很難通過產蛋鴨傳遞給雛鴨，故當前主要依靠對雛鴨注射弱毒 疫苗或特異性的卵黃抗體來防治該病的發(fā)生。然而大量實驗證實，不同基因型的DHAV之間 缺乏交叉保護能力，即使用針對DHAV-A的弱毒疫苗或卵黃抗體對防治DHAV-C的感染不起 作用，反之亦然。由于兩種基因型的病毒感染雛鴨后所表現出的臨床癥狀和病理變化非常 相似，僅憑眼觀病理變化無法辨別；且當前DHAV-A和DHAV-C的共流行現象日趨嚴重，給該 病的正確診斷和防治帶來了極大的困難。故迫切需要建立一種可行的方法，能快速檢測患 病雛鴨所感染的DHAV屬于何種基因型，以此來指導臨床正確使用同型的卵黃抗體和弱毒 疫苗。
[0003] 目前，使用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)檢測DHAV的基因片段是其主要的快 速檢測方法，但該方法不能對病毒進行定量。也有報道同時使用兩對引物用以檢測和區(qū)分 DHAV-A和DHAV-C，但該方法的靈敏度以及操作的簡便性都有所欠缺，并需要進行核酸電泳 才能完成從而增加了檢測的耗時。熒光定量RT-PCR技術因具有特異性、準確性、全封閉反 應等優(yōu)點，已經成為快速檢測病原微生物的重要手段。將RRT-PCR應用于DHAV的檢測已 有報道。Miao等建立了 Taq man探針法的RRT-PCR技術分別檢測鴨胚和雞胚尿囊液中的 DHAV-A。根據DHAV-A的3D基因保守區(qū)序列設計水解探針和引物，可檢測到大約10個拷貝 的DHAV-A的基因組RNA。Huang等建立了 SYBR Green法的RRT-PCR技術用以檢測臨床組織 中的DHAV-C。根據DHAV-C的2C基因保守區(qū)序列設計一對引物，可檢測到大約3000個拷貝 的DHAV-C的基因組RNA。但目前尚未有關使用一種RRT-PCR來鑒別診斷不同基因型DHAV 的報道。由于SYBR Green熒光染料因能與所有的DNA雙鏈相結合，對模板沒有選擇性，且 其價格便宜故更適用于多種目的產物的檢測。溶解曲線分析法是把SYBR Green法擴增后 的PCR產物從一定的溫度開始緩慢上升至95°C，擴增產物雙鏈DNA隨溫度升高逐漸變性解 鏈產生單鏈。解鏈過程中嵌到雙鏈中的熒光染料SYBR Green會被釋放出來，儀器自動檢測 反應管內熒光信號的變化，最后繪制出擴增產物熒光信號隨溫度變化的溶解曲線，并得到 相應PCR產物的溶解曲線峰圖。因此不同大小，不同基因組成的PCR產物，其溶解曲線峰型 圖不一樣。
[0004] 本發(fā)明通過比較大量不同基因型的DHAV，在其G+C含量差異明顯的5' UTR區(qū)域， 設計出一對引物能夠同時擴增DHAV-A和DHAV-C ;并通過比較擴增產物的溶解曲線來簡便、 快速地鑒別檢測樣品中的病毒基因型。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光定量PCR熔解曲線法 的DHAV(甲型鴨肝炎病毒）分型檢測法。本發(fā)明檢測方法在一個PCR反應體系中僅加一 對引物，單管檢測A、C基因型，方法簡單易行，耗時少；整個擴增和檢測過程均為閉管操作， 避免了 PCR擴增產物的污染，減少了假陽性結果；本檢測法擴增片段短，采用較高的退火溫 度，保證了擴增的特異性。熒光定量PCR儀擴增后經熔解曲線步驟后即可通過Tm值簡便、 快速地鑒別DHAV基因型。本發(fā)明建立了一種快速檢測分型鴨甲肝病毒的方法，給該病的正 確診斷和防治提供了極大的便利，為農業(yè)生產帶來經濟效益。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的甲型鴨肝炎病毒分型 檢測用引物，所述引物如下：
[0008]DHAV-F:5'GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGT 3'，
[0009]DHAV-R:5,ACTCGACCAGCCGCGACCCTAT 3,。
[0010] 第二方面，本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的甲型鴨肝炎病毒分型 檢測用陽性質粒，所述質粒包括PMD-19T-DHAV-A和pMD-19T-DHAV-C。
[0011] 第三方面，本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的甲型鴨肝炎病毒分型 檢測用陽性質粒標準品；
[0012] 所述陽性質粒標準品中所述質粒的濃度為lX10ncopies/yL ;使用過程中可以 稀釋為濃度梯度。
[0013] 第四方面，本發(fā)明提供一種基于熒光定量PCR熔解曲線法的甲型鴨肝炎病毒分型 檢測方法，所述檢測方法包括：
[0014] 步驟一、病毒RNA的提取和CDNA合成：從攻毒鴨組織中提取甲型鴨肝炎病毒總 RNA，反轉錄得cDNA ;
[0015] 步驟二、陽性標準模板的制備：以所述cDNA為模板，以所述DHAV-F和DHAV-R為引 物，對甲型鴨肝炎病毒的目的基因進行PCR擴增；用所述PCR擴增產物構建所述陽性重組質 粒；
[0016] 步驟三、基于熒光定量PCR熔解曲線法的甲型鴨肝炎病毒分型檢測方法的建立： 以所述陽性重組質粒為模板，優(yōu)化所述PCR反應條件，繪制標準曲線、熔解曲線；
[0017] 步驟四、方法驗證：將步驟三建立的實時熒光定量PCR檢測方法進行如下驗證：
[0018] 特異性試驗：采用步驟三所述熒光定量PCR檢測方法、依據所述標準曲線和熔解 曲線，對甲型鴨肝炎病毒及非甲型鴨肝炎禽源病毒進行特異性檢測；
[0019] 敏感性試驗：稀釋所述陽性質粒標準品，同時設立普通PCR對照組，分別進行擴 增，得最低模板檢出拷貝數；
[0020] 重復性試驗：分別對所述陽性質粒標準品做批內和批間重復，同時設陰性對照，通 過對甲型鴨肝炎病毒的TM值和熔解曲線的分析相關變異系數的計算，驗證所述甲型鴨肝 炎病毒分型檢測方法的重復性。
[0021] 優(yōu)選地，步驟一中，所述鴨包括北京鴨，所述組織包括肝臟。
[0022] 優(yōu)選地，步驟三中，所述PCR反應條件包括引物濃度、退火溫度。
[0023] 優(yōu)選地，所述引物濃度范圍為0. 04~1. 04umol/L ;所述退火溫度為54~62°C。
[0024] 優(yōu)選地，所述引物濃度為0. 24umol/L ;所述退火溫度為55°C。
[0025] 優(yōu)選地，步驟四的特異性試驗中，所述甲型鴨肝炎病毒包括DHAV-A、DHAV-C ;所述 非甲型鴨肝炎禽源病毒包括鴨呼腸孤病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病 毒、鵝細小病毒、鴨瘟、鴨產蛋下降綜合癥病毒、鴨坦布蘇病毒等。
[0026] 優(yōu)選地，步驟四的敏感性試驗中，所述稀釋包括按照10倍梯度稀釋；本操作實施 得出熒光定量PCR檢測方法檢測出的最低模板檢出拷貝數為100拷貝/ y L。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟四的重復性試驗中，所述批內和批間重復具體指做3個批內重 復和3個批間重復，陽性重組質粒濃度分別采用：lX10 7copies/yL、lX105copies/yL、 1 X 104copies/ y L〇
[0028] 優(yōu)選地，所述陽性質粒濃度為 1 X 107copies/ y L、1 X 105copies/ y L。
[0029] 綜上所述，本發(fā)明通過采用一對引物成功建立了基于熒光定量PCR熔解曲線法的 甲型鴨肝炎病毒分型檢測法，經熒光定量PCR儀擴增后經熔解曲線步驟后即可通過Tm值簡 便、快速地鑒別DHAV基因型。
[0030] 與現有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0031] 1、該檢測法中一個PCR反應體系中僅加有一對引物，單管檢測A、C基因型，方法簡 單易行，耗時較少；
[0032] 2、該檢測法無需使用Taq Man探針，降低了檢測成本，減少假陰性結果的出現；
[0033] 3、整個擴增和檢測過程均為閉管操作，不需開蓋吸取擴增產物進行電泳，避免了 PCR擴增產物的污染，減少了假陽性結果；
[0034] 4、該檢測法擴增片段短，采用較高的退火溫度，也可保證擴增的特異性；
[0035] 5、SYBR Green是一種不對稱腈類熒光素，能非特異性地嵌合于DNA雙螺旋結構中 的小溝內，熒光強度的大小代表DNA雙鏈分子的多少，因此從熒光強度的強弱即可初步判 斷DNA雙鏈分子的多少；
[0036] 6、當兩條DNA分子復性結合時熒光最強，隨溫度上升熒光強度降低并出現一較恒 定的坡度，當溫度達到Tm值時熒光強度急劇下降；經過軟件分析可得到熔解曲線圖，其波 峰所在的溫度代表雙鏈DNA分子的Tm值；即可通過Tm值簡便、快速地鑒別DHAV基因型；
[0037] 7、Tm值的大小取決于擴增DNA片段的長度及其序列中G/C含量，因此擴增產物不 同對應的Tm值也不同，經熔解曲線法分析后即可通過Tm值鑒別DHAV基因型，減少及排除 非特異擴增產物及引物二聚體的干擾，保證了該