一種替考拉寧的層析純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物純化領(lǐng)域，特別是一種替考拉寧的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 替考拉寧（teicoplanin)，又名太古霉素或肽可霉素。是從替考游動(dòng)放線菌屬 (Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 第 31121 號(hào)）發(fā)酵液中提取得到的糖肽類 物質(zhì)，它是繼萬古霉素之后的又一目前臨床治療多重耐藥菌感染的重要抗生素。替考拉寧 的抗菌活性機(jī)理是，與敏感細(xì)菌細(xì)胞壁前體肽聚末端的丙氨酰丙氨酸有高親和力，通過與 之結(jié)合，阻斷構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的高分子肽聚糖合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁缺損而殺滅細(xì)菌。此外，替 考拉寧也可能改變細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性，并選擇性地抑制RNA的合成。替考拉寧作用特點(diǎn)是： 對(duì)大多數(shù)金黃色葡萄球菌的作用強(qiáng)于萬古霉素，對(duì)表皮葡萄球菌的作用與萬古霉素相似； 但對(duì)腸球菌殺菌作用弱于去甲萬古霉素。由于替考拉寧獨(dú)特的作用機(jī)制，很少出現(xiàn)耐替考 拉寧的菌株。所以替考拉寧對(duì)青霉素類及頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類、氨 基糖苷類、利福平耐藥的革蘭陽性菌仍有較好的抗菌活性。
[0003] 替考拉寧主要由A2_p A2_2、A2_3、A2_ 4、A2_5和A H 6個(gè)結(jié)構(gòu)相近的單一組分組成。歐 洲藥典對(duì)各個(gè)組分做出了明確的規(guī)定，A2組之和不小于80. 0%，其中A2-2為35. 0 %~ 55.0%4_1為_3為_4為_5均不大于20.0%^ 3_1不大于15.0%，不純組分不大于5.0%。替 考拉寧的結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
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[0006] 替考拉寧現(xiàn)已普遍使用液相層析法進(jìn)行提純，如中國(guó)專利CN101302248A、美國(guó)專 利US2005245481A1等，但這些專利對(duì)于A2各組分比例不能很好的控制，不能達(dá)到歐洲藥典 的標(biāo)準(zhǔn)，并且所使用的流動(dòng)相用量大，提純時(shí)間長(zhǎng)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)周期被拉長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種替考拉寧的層析純化方法，不僅達(dá)到高純度和高回收 率，而且流動(dòng)相使用量小，純化時(shí)間短，從而大大縮短生產(chǎn)周期。
[0008] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種替考拉寧的層析純化方法，所述層析 提純方法是，用單分散甲基丙烯酸酯微球?yàn)橹鶎游鎏盍?，將替考拉寧溶液上樣到色譜柱后， 以甲醇水溶液為流動(dòng)相洗脫吸附在填料上的替考拉寧。
[0009] 優(yōu)選的，所述單分散甲基丙烯酸酯微球是Uni?PMM 40-500。
[0010] 優(yōu)選的，所述甲醇水溶液是35%的甲醇水溶液，其中含50mM磷酸二氫鈉，以氫氧 化鈉調(diào)溶液pH 6.0。
[0011] UnPPMM 40-500是甲基丙烯酸酯通過聚合形成的粒徑40um、孔徑5〇〇A的單 分散微球，由于微球基質(zhì)的化學(xué)組成不同，聚甲基丙烯酸酯基質(zhì)微球的疏水性弱于聚苯乙 烯基質(zhì)的微球。正是由于Uni?PMM 40-500特定的微球形態(tài)、孔徑、孔容、粒徑、表面功能 團(tuán)及聚合交聯(lián)度等的不同，使其作為層析填料或高效液相色譜填料時(shí)，具有更優(yōu)異的耐沖 擊性、耐高壓性及耐老化性，同時(shí)具有載量高、脫色效果好等優(yōu)勢(shì)。在純化替考拉寧時(shí)，以 Uni?PMM 40-500作為色譜柱的固定相，只需要低濃度的有機(jī)相的水溶液及較少量的流 動(dòng)相就可以將吸附在填料上的替考拉寧洗脫下來，達(dá)到高純度及高回收率，同時(shí)有很好的 脫色效果。
[0012] 含50mM磷酸二氫鈉、以氫氧化鈉調(diào)溶液pH 6. 0的甲醇水溶液，能夠更好地把填料 上的替考拉寧洗脫下來。
[0013] 本發(fā)明應(yīng)用單分散甲基丙烯酸酯介質(zhì)Uni?PMM 40-500作為柱層析的填料，以 含50mM磷酸二氫鈉、以氫氧化鈉調(diào)pH 6. 0的甲醇水溶液為流動(dòng)相，不但能夠高純度和高回 收率地對(duì)替考拉寧進(jìn)行層析純化，而且流動(dòng)相使用量小，純化時(shí)間短，從而大大縮短生產(chǎn)周 期。
【附圖說明】
[0014] 圖1是單分散甲基丙烯酸酯微球Uni?PMM 40-500的光學(xué)顯微鏡照片。
[0015] 圖2是實(shí)施例1中純化前的替考拉寧粗品的HPLC分析圖譜。
[0016] 圖3是實(shí)施例1中純化后的替考拉寧的HPLC分析圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這 些實(shí)施例。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 以UllfPMM 40-500為層析介質(zhì)做替考拉寧的純化：采用15*310mm玻璃色譜 柱，UnfPMM 40-500(蘇州納微科技有限公司生產(chǎn)）為層析填料裝填層析柱，裝柱體積 55ml。替考拉寧粗品水溶液濃度為20mg/ml，樣品經(jīng)過0. 45um濾膜過濾后經(jīng)高效液相分析， 替考拉寧A2的峰面積為總面積的78. 6%，上樣110ml，色譜柱載量為40mg/ml。上樣后，以 lOml/min用35%的甲醇水溶液（含50mM磷酸二氫鈉，氫氧化鈉調(diào)pH 6. 0)沖洗15個(gè)柱體 積（BV)，收集被洗脫下來的替考拉寧，經(jīng)高效液相分析，洗脫液中替考拉寧A2的峰面積為 總面積的90. 6%，回收率為80. 5%。
[0020] 實(shí)施例2
[0021] 以Ulli?PMM 40-500為層析介質(zhì)做替考拉寧的純化：采用36*460mm玻璃色譜 柱，Um?PMM 4〇-5〇〇(蘇州納微科技有限公司生產(chǎn)）為層析填料裝填層析柱，裝柱體積 842ml。替考拉寧粗品水溶液濃度為20mg/ml，樣品經(jīng)過0. 45um濾膜過濾后經(jīng)高效液相分 析，替考拉寧A2的峰面積為總面積的77. 9%，上樣1684ml，色譜柱載量為為40mg/ml。上 樣后，以40ml/min用35%的甲醇水溶液（含50mM磷酸二氫鈉，氫氧化鈉調(diào)pH 6. 0)沖洗 15BV，收集被洗脫下來的替考拉寧，經(jīng)高效液相分析，洗脫液中替考拉寧A2的峰面積為總 面積的88. 4%，回收率為78. 3%。
[0022] 實(shí)施例3
[0023] 以UniPS? 40-300為層析介質(zhì)做替考拉寧的純化：采用15*310mm玻璃色譜柱， UlliPSi^ 40-300 (蘇州納微科技有限公司生產(chǎn)）為層析填料裝填層析柱，裝柱體積55ml。替 考拉寧粗品水溶液濃度為20mg/ml，樣品經(jīng)過0. 45um濾膜過濾后經(jīng)高效液相分析，替考拉 寧A2的峰面積為總面積的79. 1%，上樣IlOml，色譜柱載量為40mg/ml。上樣后，以IOml/ min用35%的甲醇水溶液（含50mM磷酸二氫鈉，氫氧化鈉調(diào)