一種長(zhǎng)效重組人腦鈉肽融合蛋白及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效重組人腦鈉 肽融合蛋白及其制備方法與用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口老齡化進(jìn)程的加快及高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)病率的上升，心力 衰竭的發(fā)病率、死亡率也逐年增加。目前歐洲近10億人口，至少有1500萬(wàn)心衰患者；根據(jù) 中國(guó)心血管病報(bào)告2011指出，我國(guó)目前有心衰患者約420萬(wàn)人。人群中心衰的患病率約為 1. 5 %~2. 0 %，隨著年齡增加，其發(fā)病率也在增加，75歲以前為2-3 %，75-80歲的發(fā)病率為 10-20%。在過(guò)去的40年中，心衰導(dǎo)致的死亡增加了 6倍，年均心衰死亡率已達(dá)到30-50 %。 心衰的預(yù)后極差，5年生存率與惡性腫瘤相仿。我國(guó)五十家醫(yī)院住院病例調(diào)查報(bào)告顯示，心 力衰竭住院率占同期心血管病的20% ;死亡率占40%。
[0003] 心衰的治療，一方面應(yīng)該通過(guò)強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)血管來(lái)改善癥狀，另一方面應(yīng)該抑制 神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過(guò)度激活、改善心室重構(gòu)以消除慢性心衰的發(fā)病基礎(chǔ)。目前治療心衰的 常用藥物主要包括利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI)/血管緊張素 II受體拮抗劑 (ARB)、β受體阻滯劑、醛固酮受體拮抗劑和洋地黃類藥物。雖然，這些常規(guī)藥物對(duì)改善心 衰癥狀起到了良好的作用，但是心衰患者的總體預(yù)后仍較差，其產(chǎn)生的副作用主要表現(xiàn)在 藥物耐受性、心動(dòng)過(guò)速及其它心律失常、低血壓、以及激活與心力衰竭病理過(guò)程有關(guān)的神經(jīng) 激素-血管緊張素系統(tǒng)。因此，為了更有效地治療心衰、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)、改善患者的預(yù)后、提 高患者生存期，新型藥物的研宄也不斷地發(fā)展。目前已獲得指南推薦的治療新藥有伊伐布 雷定、奈西利肽、左西孟旦以及托伐普坦等，為一系列的循證醫(yī)學(xué)提供了依據(jù)。
[0004] 奈西立肽，又稱重組人腦利鈉肽（rhBNP)，用于治療急性充血性心衰，屬內(nèi)源性激 素物質(zhì)，與人心室肌分泌的天然BNP具有相同的32個(gè)氨基酸序列（如下式）。
[0005] Ser Pro Lys Met Val GlnGlySerGlyCysPheGlyArg Lys Met Asp Arg He SerSer
[0006] SerSerGlyLeuGlyCys Lys Val LeuArgArg His
[0007] 奈西立肽氨基酸序列
[0008] hBNP與血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞上的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)第二信 使環(huán)單磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP)的水平升高，從而引發(fā)一系列生理效應(yīng)：（1)具有內(nèi)皮非依賴性的 血管舒張活性，擴(kuò)張動(dòng)靜脈，降低全身血管阻力、充盈壓以及肺毛細(xì)血管嵌楔壓（pulmonary capillarywedge pressure，PCWP)，降低心臟前后負(fù)荷；（2)提高腎小球?yàn)V過(guò)率，產(chǎn)生排鈉利 尿作用，降低體液負(fù)荷，提高心排血量，綜合性改善心臟功能；(3)在體內(nèi)抑制腎素-血管緊 張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS)的激活，抑制由于擴(kuò)血管效應(yīng)引起的反射性心率增加，避免心律 失常的發(fā)生；(4)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)心肌肥厚有抑制 作用。因此，rhBNP有利于減輕心衰患者的呼吸困難程度和全身癥狀，不同于以前單一的血 管擴(kuò)張藥物或利尿劑，是一個(gè)具有多種治療作用的藥物。但是，目前臨床應(yīng)用的rhBNP由于 體內(nèi)半衰期短（僅為18min)，須頻繁給藥才能達(dá)到治療目的，影響患者用藥的順應(yīng)性，進(jìn)而 影響了產(chǎn)品在臨床上的廣泛應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明從解決現(xiàn)有rhBNP半衰期短的不足出發(fā)，通過(guò)將rhBNP與人IgG4Fc片段絞 鏈區(qū)中的半胱氨酸（Cys)殘基連接，形成類似IgG4、但缺少CHl區(qū)域和輕鏈的rhBNP-Fc融 合蛋白從而達(dá)到延長(zhǎng)rhBNP的循環(huán)半衰期/增加生物活性，并達(dá)到延長(zhǎng)藥物有效時(shí)間、減少 藥物副作用等目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種長(zhǎng)效重組人腦鈉肽融合蛋白（Human Brain Natriumretic-Fc fusion protein，重組 hBNP-Fc 融合蛋白，簡(jiǎn)稱 hBNP-Fc)，所述 hBNP-Fc 具有半衰期長(zhǎng)、生物活性高等有益效果。
[0011] 本發(fā)明的上述有益效果通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種重組hBNP-Fc融合蛋白，其 特征在于所述的融合蛋白其單鏈的氨基酸序列從N端到C端依次包含人BNP (hBNP)、肽接頭 和人IgG4Fc變體。
[0012] 具體的，所述融合蛋白為二聚化融合蛋白（如圖Ib所示），所述的人IgG4Fc變體 為
[0013] 含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。IgG4Fc變 體CH2區(qū)域在228、235 (由EU編號(hào)體系確定的位置）含有氨基酸突變，有利于維持IgG4的 空間結(jié)構(gòu)以及降低Fc的效應(yīng)子功能，并且在純化融合蛋白時(shí)有助于獲得均勻完整的制備 物（美國(guó)專利 No. 6, 797, 493、6, 900, 292、6, 204, 007)。
[0014] 所述的肽接頭含有2-20個(gè)氨基酸，存在于hBNP和人IgG4Fc變體之間，且所述的 肽接頭含有兩個(gè)或更多選自甘氨酸（Gly)和蘇氨酸（Thr)的氨基酸。優(yōu)選的，所述肽接頭 的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0015] 所述的重組hBNP-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0016] IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用的IgG4Fc片段與 hBNP融合，可增強(qiáng)hBNP生物活性，并對(duì)hBNP蛋白具有穩(wěn)定作用，而所得融合蛋白具有較低 的抗體依賴細(xì)胞毒性（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxic，ADCC)和補(bǔ)體依賴 細(xì)胞毒性（Complement Dependent Cytotoxicity，CDC)活性，副作用較小。
[0017] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供了一種與本發(fā)明重組hBNP-Fc融合蛋白相匹配的 制備方法，該制備方法包含如下步驟：
[0018] (1)構(gòu)建編碼重組hBNP-Fc融合蛋白的基因表達(dá)載體；
[0019] (2)構(gòu)建高表達(dá)重組hBNP-Fc融合蛋白的工程細(xì)胞株；
[0020] (3)批次流加培養(yǎng)工程細(xì)胞株，以表達(dá)重組hBNP-Fc融合蛋白；
[0021] (4)重組hBNP-Fc融合蛋白的分離純化。
[0022] 具體的，所述步驟（1)的具體步驟為：采用人工合成方法獲得編碼重組hBNP-Fc融 合蛋白基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO. :3所示，包含前導(dǎo)肽序列），插入到哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)載體，獲得含有hBNP-Fc目的基因的表達(dá)質(zhì)粒（如圖3所示）。
[0023] 所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體可采用但不限于市售的如：p⑶NA3. 1(+)、pCMV/ ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體，優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物細(xì) 胞表達(dá)載體為PCDNA3. 1 (+)。
[0024] 所述步驟⑵的具體步驟為：將步驟⑴所得含有hBNP-Fc目的基因的表達(dá)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染到合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，并篩選獲得穩(wěn)定、高表達(dá)目的融合蛋白的細(xì)胞株。
[0025] 所述的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NSO、Sp2/0細(xì)胞。優(yōu) 選的，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞；更優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞為 DHFR(DihydrofolateReductase，二氫葉酸還原酶）缺陷型 CHO 細(xì)胞（簡(jiǎn)稱 CHO-DHFIT)。
[0026] 所述的轉(zhuǎn)染方法選自磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，優(yōu)選電穿孔轉(zhuǎn)染 法。
[0027] 所述的篩選穩(wěn)定、高表達(dá)目的融合蛋白的細(xì)胞株的方法為：先利用篩選標(biāo)記進(jìn) 行篩選，然后用擴(kuò)增選擇性標(biāo)記可提高表達(dá)量并獲得穩(wěn)定高表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞株。所述 篩選標(biāo)記是本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一種合適的選擇性抗性標(biāo)記，如ZE0(Zeocin，博來(lái)霉 素 ）、NEO (Neomycin,新霉素）、PUR(puromycin,嗓呤霉素 ）、HYP (Hygromycin,潮霉素）， 優(yōu)選NEO ;所述篩選標(biāo)記也可為本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一個(gè)熒光標(biāo)記基因，包括GFP (Green Fluorescent Protein，綠色焚光蛋白）、RFP (RedFluore