一種水稻工程保持系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水稻工程保持系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高水稻產(chǎn)量最有效的途徑。"三系法"雜交水稻對(duì)種質(zhì)資源 利用率低以及"兩系法"雜交水稻雜交制種安全性約束是影響雜交水稻種植推廣面積進(jìn)一 步擴(kuò)大的重要因素。發(fā)明新的育種技術(shù)，開發(fā)出對(duì)種質(zhì)資源利用率高、雜交制種安全的水稻 雜種優(yōu)勢(shì)利用方法是雜交水稻發(fā)展的方向。普通隱性核不育材料不育性穩(wěn)定、雜交制種安 全，易于配制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗組合；共同的缺點(diǎn)是無法實(shí)現(xiàn)不育系種子的批量繁殖。
[0003] 針對(duì)隱性核雄性不育材料的繁殖問題，育種家也先后提出多種解決方案，主要包 括：（1)根據(jù)雄性不育機(jī)理，通過施加缺失的代謝中間物質(zhì)（如氨基酸、黃酮、脂肪酸等物 質(zhì)），使突變不育株恢復(fù)育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用條件控制（如誘導(dǎo)性） 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)育性恢復(fù)基因表達(dá)，給予適合的啟動(dòng)子表達(dá)條件時(shí)，育性恢復(fù)基因表達(dá)，育性恢 復(fù)而得以繁殖；而不給予適合啟動(dòng)子表達(dá)的條件時(shí)，育性恢復(fù)基因不表達(dá)，即為不育系。此 外，也可以利用條件控制啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)作物內(nèi)源育性基因的抑制因子表達(dá)而達(dá)到上述同樣的 目的。以上這些方案在不同作物的實(shí)際生產(chǎn)中得到了不同程度的應(yīng)用，但由于不育系的育 性轉(zhuǎn)換不能被完全精確地控制，或者不育系中含有轉(zhuǎn)基因成分并因而造成雜交種中含有轉(zhuǎn) 基因等問題，都沒有得到廣泛的應(yīng)用。
[0004] 隨著分子設(shè)計(jì)育種思想和技術(shù)的進(jìn)步，開發(fā)能夠精確控制的不帶轉(zhuǎn)基因成分的不 育系的繁殖技術(shù)，成為分子設(shè)計(jì)雜交育種技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。1993年6月11日，國(guó) 外生物技術(shù)公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一項(xiàng)PCT專利申請(qǐng)，該專利提出以下技術(shù)思 想：在隱性雄性不育植株中導(dǎo)入連鎖表達(dá)的育性恢復(fù)基因、花粉致死（敗育）基因以及篩 選標(biāo)記基因（如熒光蛋白基因）三套元件，可以獲得該雄性不育植株的保持系，保持系通 過自交就可以實(shí)現(xiàn)不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通過在純 合的雄性不育植株中導(dǎo)入連鎖表達(dá)的育性恢復(fù)基因和篩選標(biāo)記基因兩套元件，由此獲得該 雄性不育植株的保持系，保持系與不育株雜交即可繁殖不育系和保持系。兩種方法提出了 利用精確的分子生物技術(shù)手段，解決隱性核雄性不育基因及不育材料的應(yīng)用問題，為開展 分子設(shè)計(jì)雜交育種提供了技術(shù)框架。相比較而言，三元件系統(tǒng)考慮到花粉逃逸和轉(zhuǎn)基因生 態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的問題，較雙元件系統(tǒng)思路更加縝密。2006年，美國(guó)杜邦先鋒公司在三元件系統(tǒng)技 術(shù)思路基礎(chǔ)上，首先在玉米中實(shí)現(xiàn)了基于核不育突變材料的種子生產(chǎn)技術(shù)，并命名為Seed Production Technology(SPT)技術(shù)。2010年9月，在中國(guó)科技部"國(guó)家高技術(shù)研宄發(fā)展計(jì) 劃"的支持下，三元件系統(tǒng)技術(shù)思想在水稻中得到了證實(shí)和應(yīng)用，并被稱之為"智能不育雜 交育種技術(shù)"或"第三代雜交水稻技術(shù)"。通過項(xiàng)目的實(shí)施，將有力推動(dòng)智能不育分子設(shè)計(jì) 技術(shù)在作物育種中的研宄應(yīng)用，使我國(guó)在水稻雜交育種領(lǐng)域繼續(xù)保持國(guó)際領(lǐng)先優(yōu)勢(shì)，為促 進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)和產(chǎn)品支持。
[0005] 從思路上來說，SPT技術(shù)幾乎完美，既可以實(shí)現(xiàn)普通核不育系的繁殖，又可以消除 人們對(duì)于轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂，因?yàn)殡s交后代植株中沒有外源的轉(zhuǎn)基因元件，不存在轉(zhuǎn)基因 生物安全問題。但是在實(shí)際操作過程中會(huì)遇到以下幾個(gè)問題：（1)轉(zhuǎn)化受體取材受到限制， 因?yàn)榛パa(bǔ)載體要轉(zhuǎn)化到不育植株中去，因此只有選擇不育水稻植株的幼穗誘導(dǎo)愈傷組織； 取材受到很大限制，并且有效取材時(shí)間很短；(2)育性恢復(fù)基因的導(dǎo)入對(duì)突變不育株的表 型恢復(fù)并不十分理想，對(duì)于后續(xù)的制種產(chǎn)量影響很大。原因可能與載體序列在受體基因組 上的插入位點(diǎn)有關(guān)，側(cè)翼序列的特征對(duì)育性恢復(fù)基因的表達(dá)水平可能會(huì)有影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種水稻工程保持系的構(gòu)建方法，本發(fā)明通過CRISPR/ Cas9系統(tǒng)將外源報(bào)告基因整合到野生型水稻的染色體上，解決了轉(zhuǎn)化受體材料受限制的問 題。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的提高水稻工程保持系在水稻育種中的應(yīng)用，本發(fā)明的水稻工 程保持系可用于水稻普通隱性雄性核不育系繁殖中，培育后的水稻工程保持系產(chǎn)品可機(jī)械 化、規(guī)?；瘧?yīng)用于水稻普通核不育系的繁殖制種中，且過程簡(jiǎn)單、操作方便。
[0009] 為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] 一種水稻工程保持系的構(gòu)建方法，包括：
[0011] 步驟一、將外源報(bào)告基因定點(diǎn)整合到野生型水稻的染色體上得到含有外源報(bào)告基 因的轉(zhuǎn)基因株系，其中，該外源報(bào)告基因與野生型育性調(diào)控基因能夠緊密連鎖遺傳；以及， 之后進(jìn)入步驟二，
[0012] 步驟二、將步驟一中得到的轉(zhuǎn)基因株系與純合隱性水稻普通雄性核不育株系雜 交，篩選含有所述外源報(bào)告基因的株系即為所需要的水稻工程保持系，其中，該純合隱性水 稻普通雄性核不育株系為所述育性調(diào)控基因突變體株系。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法，在所述步驟一之前還包括：通過圖 位克隆確定出純合隱性水稻普通雄性核不育株系中突變型育性調(diào)控基因在染色體上的位 置。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述步驟一中，將外源報(bào)告基 因定點(diǎn)整合到野生型水稻的染色體上獲得含有外源報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因株系的具體方法包 括：
[0015] (1. 1)分析野生型水稻染色體上育性調(diào)控基因的上下游序列區(qū)域，取該區(qū)域內(nèi) NGG前面的20bp作為靶位點(diǎn)區(qū)域，并設(shè)計(jì)與該靶位點(diǎn)區(qū)域配對(duì)的引物序列，在引物上游序 列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物
[0016] 上游序列：5' -GCAA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（SEQ ID NO :1)
[0017] 下游序列：5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'（SEQ ID NO :2);
[0018] (1. 2)根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將步驟（1. 1)中的引物序列構(gòu)建到pPIC. 1載體上 得到基因整合載體；
[0019] (1. 3)將外源報(bào)告基因構(gòu)建到表達(dá)載體上得到重組表達(dá)載體；
[0020] (1. 4)將所述重組表達(dá)載體和所述基因整合載體共轉(zhuǎn)化野生型水稻，得到轉(zhuǎn)基因 植株；
[0021] (1. 5)在靶位點(diǎn)兩翼設(shè)計(jì)引物，以轉(zhuǎn)基因植株基因組進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增產(chǎn)物片段大 小與外源報(bào)告基因片段大小大致相等，則判定該植株為含有外源報(bào)告基因的水稻轉(zhuǎn)基因株 系，并且在靶位點(diǎn)定點(diǎn)插入整合。
[0022] 優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述步驟（1. 3)中，所述表達(dá)載 體采用過表達(dá)載體。
[0023] 優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述重組表達(dá)載體中，所述外源 報(bào)告基因的核苷酸序列前構(gòu)建有水稻胚乳特異性啟動(dòng)子Gtl。
[0024] 較優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述育性調(diào)控基因?yàn)樗?EAT1基因。
[0025] 較優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述步驟（1. 1)中的引物序 列為：
[0026] 上游序列：5' -GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCAITT-3'（SEQ ID NO :3)
[0027] 下游序列：5' -AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3'（SEQ ID NO :4)。
[0028] 較優(yōu)選的是，所述的水稻工程保持系的構(gòu)建方法中，所述外源報(bào)告基因?yàn)榧t色熒 光標(biāo)記基因、紅色熒光蛋白標(biāo)記基因、綠色熒光蛋白基因、或藍(lán)色熒光標(biāo)記基因中的任意一 種。
[0029] 水稻工程保持系在水稻育種中的應(yīng)用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法獲 得。
[0030] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0031] 本發(fā)明通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將外源報(bào)告基因整合到野生型水稻的染色體上，解 決了轉(zhuǎn)化受體材料受限制的問題。外源片段的定點(diǎn)整合綜合考慮了育性調(diào)控基因和篩選報(bào) 告基因的表達(dá)，避免了以前轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合位點(diǎn)導(dǎo)致的目的基因表達(dá)的不確定性。
[0032] 本發(fā)明的水稻工程保持系可用于水稻普通隱性雄性核不育系繁殖中，培育后的水 稻工程保持系產(chǎn)品可機(jī)械化、規(guī)?；瘧?yīng)用于水稻普通核不育系的繁殖制種中，且過程簡(jiǎn)單、 操作方便。
[0033] 定義
[0034] 為了便于理解本發(fā)明，定義了大量術(shù)語和短語
[0035] 本發(fā)明中的"反向互補(bǔ)"，指通過堿基配對(duì)原則關(guān)聯(lián)的核苷酸序列。例如，序列 ''5' -A-T-G-3"' 與序列 "5' -C-A-T-3"' 反向互補(bǔ)。
[0036] 術(shù)語"基因"是指一種DNA分子，基因是遺傳變異的主要物質(zhì)，是控制生物性狀的 基本遺傳單位，基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的堿基序列成為結(jié)構(gòu)基因，本發(fā)明中所稱的基因 為結(jié)構(gòu)基因。
[0037] "野生型基因"是指一種從來源中分離的基因，本發(fā)明的"野生型基因"是首先利用 水稻不育突變體通過圖位克隆方法得到突變基因的位置，然后從水稻野生型中獲得該位置 處的對(duì)應(yīng)的基因的序列，即為"野生型基因"。而"突變的基因"是指一種基因，與"野生型基 因"相比，其具有序列和/或功能性質(zhì)的修飾（即改變的特征）。
[0038] "等位基因"一般指位于一