水稻根系特異表達(dá)啟動子發(fā)掘及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了rRSP1、rRSP3、rRSP5三個水稻內(nèi)源啟動子在根系特異驅(qū)動中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列1-5啟動子及其組織活性與表達(dá)模式。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rRSP1、rRSP3、rRSP5只在根系中特異表達(dá)，rRSP2和rRSP4在根系和地上組織都有活性，在根系中具有很高的活性，在地上組織中有較弱的表達(dá)活性。本發(fā)明為研究植物根系性狀，根系性狀相關(guān)育種或品種改良方面具有十分重要的理論和應(yīng)用價值。
【專利說明】水稻根系特異表達(dá)啟動子發(fā)掘及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中水稻根系特異表達(dá)基因分析、啟動子rRSPl-5克隆及其活性分析。
【背景技術(shù)】
[0002]在基因工程研究及應(yīng)用中，主要采用組成型驅(qū)動的啟動子，如(CaMV)35S啟動子、水稻Actin (OsActl、0sAct2)啟動子、玉米泛素基因(ZmUbil)啟動子,水稻a-tubulin基因(OsTubAl)啟動子、水稻泛素基因(RUBQl、RUBQ2、rubi3)啟動子等，雖然組成型啟動子驅(qū)動的目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中高表達(dá)，但有些基因在過量表達(dá)后會產(chǎn)生許多非預(yù)期效益，因此，在許多研究和應(yīng)用中，需要使用組織特異啟動子在特定組織或器官中表達(dá)某些基因來取得更好的效果。
[0003]植物根系具有固定植物、吸收作物生長發(fā)育需要的水分和養(yǎng)分、合成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用?，F(xiàn)在已經(jīng)在不同植物中鑒定并使用了許多根系特異啟動子，它們可以驅(qū)動根系特異表達(dá)基因在根系中特異表達(dá)。由于rolD啟動子具有與植物根系特異啟動子順式元件類似的基序，因此，研究者成功的利用了來源于發(fā)根農(nóng)桿菌rolD啟動子驅(qū)動谷氨酸合成酶、高親和能力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在植物根系中特異表達(dá)。CaMV35S上的Domain A (上游290bp)是第二個鑒定的來源與非植物的根系特異啟動子，與rolD啟動子相比，DomainA驅(qū)動⑶S的表達(dá)活性要弱5-15倍，并且主要在根尖表達(dá)。煙草TobRB7啟動子是一種重要的植物源根系特異啟動子，已廣泛應(yīng)用于基因工程研究中。關(guān)于根系特異表達(dá)相關(guān)研究已取得重大進(jìn)展=PYKlO啟動子驅(qū)動的細(xì)胞分裂素相關(guān)基因在根系中特異高表達(dá)促進(jìn)了擬南芥和煙草根系的發(fā)育和伸長；RCc3啟動子驅(qū)動水稻根系特異高表達(dá)OsNACIO大大提高了植株對干旱、高鹽和低溫的適應(yīng)能力。
[0004]根系特異啟動子對于研究根系特異表達(dá)基因相關(guān)功能及其應(yīng)用意義重大，也取得了一定進(jìn)展，但對于整個生育期根系特異表達(dá)方面，尤其是對于單子葉植物根系特異表達(dá)啟動子的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。而同種植物根系特異啟動子在不同物種中的應(yīng)用存在特異性、活性降低等問題，因此發(fā)掘單子葉植物(水稻)內(nèi)源根系特異啟動子對研究根系相關(guān)性狀具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供序列表中序列1、3、5所示的根系特異表達(dá)啟動子rRSPl、rRSP3、rRSP5和序列表中2、4所示的根系主要表達(dá)啟動子rRSP2、rRSP4。
[0006]本發(fā)明提供了序列表中序列1、2、3、4、5所示的啟動子rRSPl、rRSP2、rRSP3、rRSP4、rRSP5在根系特異或主要表達(dá)驅(qū)動中的應(yīng)用；所述啟動子為如下1)_3)中任一所述的序列；
[0007]I)序列表中序列1、2、3、4、5所示的DNA分子；
[0008]2)在嚴(yán)格條件下與I)所不的DNA分子雜交的DNA分子；[0009]3)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性的DNA分子。
[0010]含有序列表中序列1、2、3、4、5所示啟動子重組表達(dá)載體在驅(qū)動根系特異表達(dá)或主要表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，在報告基因⑶S前插入序列表中序列1、2、3、4、5所示啟動子,構(gòu)建得到重組表達(dá)載體。
[0012]所述植物為單子葉植物-水稻，包括雙子葉植物。
[0013]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列1、2、3、4、5所示的啟動子驅(qū)動GUS的表達(dá)盒導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物報告基因GUS只在根系中特異表達(dá)。
[0014]本發(fā)明通過本實(shí)驗(yàn)室已有的水稻全基因組時空表達(dá)譜，發(fā)掘了 7個根系特異表達(dá)基因，利用Real-time PCR進(jìn)行對葉片和根系進(jìn)行了深入驗(yàn)證，克隆并構(gòu)建了 5個基因啟動子(rRSPl、rRSP2、rRSP3、rRSP4、rRSP5)的⑶S融合表達(dá)載體，遺傳轉(zhuǎn)化水稻Kitaake，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行⑶S組織化學(xué)染色分析。結(jié)果表明rRSPl、rRSP3、rRSP5只在根系中特異表達(dá)，rRSP2和rRSP4在根系和地上組織都有活性，但在根系中具有很高的活性，在地上組織中有較弱的表達(dá)活性，為根系主要表達(dá)啟動子。本發(fā)明為研究植物根系性狀，根系性狀相關(guān)育種或品種改良方面具有十分重要的理論和應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為根系特異表達(dá)基因啟動子區(qū)保守Motif
[0016]圖2為半定量RT-PCR檢測R1-R7組織表達(dá)模式和響應(yīng)脅迫表達(dá)模式
[0017]圖3為熒光定量PCR檢測R1-R7組織表達(dá)模式
[0018]圖4為熒光定量PCR檢測R1-R7在根系中響應(yīng)脅迫表達(dá)模式
[0019]圖5為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽性檢測
[0020]圖6為轉(zhuǎn)基因植株苗期⑶S組織染色
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0022]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023]實(shí)施例1、水稻根系特異高表達(dá)基因發(fā)掘及驗(yàn)證
[0024]日本晴(Nipponbare,Oryza sativa ssp.japonica)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:Yongqing Jiao, Yonghong Wang, DaweiXue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong,Dali Zeng,Zefu Lu，Xudong Zhu,Qian Qian and Jiayang Li(2010)Regulation of 0sSPL14by 0smiR156defines idealplant architecture in rice.Nature Genetics，42，541-544)；
[0025]Kitaake (Oryza sativa ssp.japonica)(公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:(Kinoshita et al.1989 ；Takamure andKinoshital993)。
[0026]1、利用水稻全基因組時空表達(dá)譜發(fā)掘水稻根系特異表達(dá)基因
[0027]根據(jù)旱脅迫下水稻全基因組時空表達(dá)譜(Di Wang, Yajiao Pan, Xiuqin Zhao,Linghua Zhu，Binying Fu，Zhikang Li,Genome-wide Temporal-spatial Gene ExpressionProfiling of Drought Responsiveness in Rice.BMC Genomics2011，12:149)和鹽脅迫下水稻全基因組學(xué)時空表達(dá)譜(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，篩選在根系中特異表達(dá)，而受旱脅迫和鹽脅迫表達(dá)無差異基因(fold change < 2.0),共有462個基因；然后根據(jù)其信號值,選擇在根系中聞表達(dá)基因，共挑選了 43個基因。然后對著43個根系特異表達(dá)基因上游Ikb序列進(jìn)行保守Motif分析，發(fā)現(xiàn)3個相對保守的Motif (圖1)，并選擇了 7個保守Motif數(shù)量最多的基因(初步命名為R1-R7，表1)進(jìn)行下一步分析驗(yàn)證。
[0028]表1候選基因及其啟動子等信息
[0029]
【權(quán)利要求】
1.序列表中序列1-5所示的啟動子DNA在根系特異表達(dá)或主要表達(dá)中的應(yīng)用。所述啟動子為如下I)-3)中任一所述的基因； 1)序列表中序列1、2、3、4、5的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)所不的DNA分子雜交的DNA分子； 3)與1)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
2.含有序列表中序列1、2、3、4、5所示DNA的重組表達(dá)載體在植物中啟動轉(zhuǎn)錄中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為在特定基因前插入所述序列表中序列1、2、3、4、5所示啟動子DNA得到的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
5.含有權(quán)利要求1、2或3所述啟動子DNA的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述序列表中序列1、2、3、4、5所示的DNA具有90%以上同源性DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，啟動目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，在其DNA前加上增強(qiáng)子、抑制子等元件。
【文檔編號】C12N15/113GK103468682SQ201310465919
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月9日
【發(fā)明者】傅彬英, 黃立鈺, 張帆, 王文生, 黎志康 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所