icalandApplied Genetics94:583-591完成。這些遺傳作圖研宄的結(jié)果顯示在油菜中存在FAD2基因的4個 拷貝。
[0123] 自油菜變種DH12075構(gòu)建的BAC文庫的測序分析導(dǎo)致了四種BAC序列的分離（SEQ IDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3,和SEQIDN0:4)，由此確定了FAD2A(SEQIDN0:5)， 卩八02-1(5￡〇10勵:6)，卩六02-2(5￡〇10勵:7)，和卩六02-3(5￡〇10勵:8)基因的編碼序列。 鑒定FAD2A，F(xiàn)AD2-1，F(xiàn)AD2-2,和FAD2-3基因序列并進(jìn)行遺傳作圖。使用序列比對程序和 利用同一性百分比的鄰居連接樹進(jìn)行四種FAD2基因的序列分析。經(jīng)由來自VectorNTI Advance11.0 計(jì)算機(jī)程序（LifeTechnologies，Carlsbad，CA)的AlignX?程序進(jìn)行序列 比對，并顯示于圖1中。AlignX?使用改良的ClustalW算法來生成蛋白質(zhì)或核酸序列的 多重序列比對以進(jìn)行相似性比較和注解。用JalviewV2.3?軟件產(chǎn)生鄰居連接樹，并顯示 于圖 2。（Waterhouseetal. (2009)Bioinformatics25 (9) :1189-1191)。如圖 2 中所不， 分離的序列的分析指示FAD2A和FAD2-3序列共享高水平的序列相似性，同樣地，F(xiàn)AD2-1和 FAD2-2共享高水平的序列相似性。四種序列可分類為兩個進(jìn)化枝，其中FAD2A和FAD2-3構(gòu) 成第一進(jìn)化枝，而FAD2-1和FAD2-2構(gòu)成第二進(jìn)化枝。
[0124] 接著，用自油菜新分離的FAD2序列對自蕪菁基因組BAC文庫和甘藍(lán)鳥槍基因組 序列讀出分離的基因組文庫進(jìn)行BLAST。蕪菁和甘藍(lán)二者均為雙二倍體物種油菜（AC基因 組，n= 19)的二倍體祖先。油菜衍生自蕪菁（A亞基因組，n= 10)和甘藍(lán)（C亞基因組，n =9)之間的最近雜交事件。使用BLASTn分析將二倍體祖先序列與自油菜分離的四種不同 FAD2編碼序列進(jìn)行比較。此序列分析自蕪菁和甘藍(lán)鑒定出與新發(fā)現(xiàn)的油菜FAD2序列共享 最高序列相似性的具體的帶注釋的基因序列。表1列出了新鑒定的FAD2編碼序列和相應(yīng) 的祖先參照序列登錄號和來源生物體。
[0125] 表1 :來自油菜和相應(yīng)祖先生物體的FAD2序列及相關(guān)的FAD序列登錄號。
[0126]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于生成轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，該方法包括： 提供植物細(xì)胞，其具有包含可靶定核酸分子的基因組DNA，該可靶定核酸分子包含： 至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識別位點(diǎn)； 第一標(biāo)志物基因的第一片段；和 第二標(biāo)志物基因的第二片段； 用供體核酸分子和位點(diǎn)特異性核酸酶核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； 切割至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識別位點(diǎn)； 將供體核酸分子整合入可靶定核酸分子，其中可靶定核酸分子內(nèi)的整合包含至少一種 功能性標(biāo)志物基因；并 生成轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包含可靶定核酸分子和整合的、包含至少一 種功能性標(biāo)志物基因的供體核酸分子。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子包含第一和第二同源臂核酸序列。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中同源臂核酸序列為內(nèi)含子。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中第一和第二同源臂核酸序列共享少于50%序列同一性。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中第一和第二同源臂核酸序列長50bp至3kbp。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子經(jīng)非同源性依賴性方法整合入可靶定核酸分 子。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子經(jīng)同源性依賴性方法整合入可靶定核酸分 子。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子的兩端均整合入具有核苷酸序列重排的可靶 定核酸分子，其中該核苷酸序列重排包含插入、刪除、倒置和重復(fù)。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子的兩端均整合入沒有核苷酸序列重排的可靶 定核酸分子，其中該核苷酸序列重排包含插入、刪除、倒置和重復(fù)。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子的第一端整合入沒有核苷酸序列重排的可 靶定核酸分子，且供體核酸分子的第二端整合入具有核苷酸序列重排的可靶定核酸分子， 其中該核苷酸序列重排包含插入、刪除、倒置和重復(fù)。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞生成轉(zhuǎn)基因植物組織或再生成完整轉(zhuǎn) 基因植物。
12. 權(quán)利要求1的方法，其中將可靶定核酸插入基因組基因座。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中可靶定核酸分子在基因組基因座內(nèi)的插入對植物細(xì)胞的 農(nóng)藝或質(zhì)量特性沒有不利影響。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中基因組基因座選自下組：FAD2基因組基因座，F(xiàn)AD3基因 組基因座，和IPKl基因組基因座。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中FAD2基因組基因座選自下組：FAD2A，F(xiàn)AD2A'，F(xiàn)AD2C，和 FAD2C'。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中FAD3基因組基因座選自下組：FAD3A，F(xiàn)AD3A'，F(xiàn)AD3A"， FAD3C，F(xiàn)AD3C'，和 FAD3C"。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中供體核酸分子包含至少一種基因表達(dá)盒。
18. 權(quán)利要求1的方法，其中基因表達(dá)盒包含轉(zhuǎn)基因。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中轉(zhuǎn)基因選自下組：殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因，除草劑耐性轉(zhuǎn)基 因，氮利用效率轉(zhuǎn)基因，水利用效率轉(zhuǎn)基因，營養(yǎng)質(zhì)量轉(zhuǎn)基因，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因，和可選擇標(biāo) 志物轉(zhuǎn)基因。
20. 權(quán)利要求1的方法，其中用位點(diǎn)特異性核酸酶切割至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識 另Ij位點(diǎn)。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中位點(diǎn)特異性核酸酶為包含DNA結(jié)合域和切割域或切割半 域的融合蛋白。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中DNA結(jié)合域選自下組：大范圍核酸酶DNA結(jié)合域，RNA指 導(dǎo)的CRI SPR-Cas9 DNA結(jié)合域，亮氨酸拉鏈DNA結(jié)合域，轉(zhuǎn)錄激活物樣（TAL) DNA結(jié)合域，重 組酶，鋅指蛋白DNA結(jié)合域，和它們的嵌合組合。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中融合蛋白為鋅指核酸酶。
24. 權(quán)利要求21的方法，其中切割域或切割半域選自下組：來自IIS型限制性位點(diǎn)特 異性核酸酶的切割半域，來自FokI位點(diǎn)特異性核酸酶的切割半域，來自StsI位點(diǎn)特異性核 酸酶的切割半域，和歸巢位點(diǎn)特異性核酸酶。
25. 權(quán)利要求1的方法，其中第一標(biāo)志物基因的第二片段位于供體核酸分子的5'端，且 第二標(biāo)志物基因的第一片段位于供體核酸分子的3'端。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中將供體核酸分子整合入可革El定核酸分子產(chǎn)生包含第一標(biāo) 志物基因的功能性第一標(biāo)志物基因。
27. 權(quán)利要求25的方法，其中將供體核酸分子整合入可祀定核酸分子產(chǎn)生包含第二標(biāo) 志物基因的功能性第二標(biāo)志物基因。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中利用熒光活化細(xì)胞分選（FACS)篩選第一標(biāo)志物蛋白。
29. 權(quán)利要求27的方法，其中利用熒光活化細(xì)胞分選（FACS)篩選第二標(biāo)志物蛋白。
30. 權(quán)利要求26和權(quán)利要求27的方法，其中第一和第二標(biāo)志物基因表達(dá)具有不同作用 模式的標(biāo)志物蛋白。
31. 權(quán)利要求1的方法，其中第一標(biāo)志物基因的第二片段位于供體核酸分子的5'端，其 中供體核酸分子的5'端包含與內(nèi)含子可操作連接的啟動子，且第二標(biāo)志物基因的第一片段 位于供體核酸分子的3'端，其中供體核酸分子的3'端包含與內(nèi)含子可操作連接的編碼序 列。
32. 權(quán)利要求1的方法，其中第一或第二標(biāo)志物基因選自下組：PMI，YFP，Xyl (A)，RFP， DSR，GFP，⑶S，NPTII，AAD-I，AAD-12, AHAS，PAT，DSM-2, DGT-28, HPH，BAR，和熒光蛋白。
33. 權(quán)利要求1的方法，其中利用流式細(xì)胞術(shù)分離轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
34. 通過權(quán)利要求11的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物組織或完整轉(zhuǎn)基因植物。
35. 選自下組的油菜（Brassica napus)染色體靶位點(diǎn)：SEQ ID N0:431核苷酸1-579 至 SEQ ID NO: 432 核苷酸 166-732, SEQ ID NO: 433 核苷酸 1-550 至 SEQ ID NO: 434 核苷酸 190-653, SEQ ID N0:435 核苷酸 1-298 至 SEQ ID N0:436 核苷酸 51-644, SEQ ID N0:437 核苷酸 1-536 至 SEQ ID N0:438 核苷酸 146-545, SEQ ID N0:439 核苷酸 1-431 至 SEQ ID N0:440 核苷酸 167-685, SEQ ID N0:441 核苷酸 1-599 至 SEQ ID N0:442 核苷酸 116-521， SEQ ID NO:443 核苷酸 1-298 至 SEQ ID NO:444 核苷酸 193-775,和 SEQ ID NO:445 核苷酸 1-651 至 SEQ ID NO:446 核苷酸 120-578。
36. 權(quán)利要求34的油菜染色體靶位點(diǎn)，其中靶位點(diǎn)包含可靶定核酸分子，該可靶定核 酸分子包含： 至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識別位點(diǎn)； 第一標(biāo)志物基因的第一片段；和 第二標(biāo)志物基因的第二片段。
37. 權(quán)利要求34的油菜染色體靶位點(diǎn)，其中靶位點(diǎn)包含pDAS000036或pDAS000037。
38. 權(quán)利要求34的油菜染色體靶位點(diǎn)，其中靶位點(diǎn)包含外源多核苷酸序列。
39. -種用于生成轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，該方法包括： 提供植物細(xì)胞，其具有包含可靶定核酸分子的基因組DNA，該可靶定核酸分子包含： 至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識別位點(diǎn)； 第一標(biāo)志物基因的第一片段；和 非編碼多核苷酸序列的第二片段； 用供體核酸分子和位點(diǎn)特異性核酸酶核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞； 切割至少一個位點(diǎn)特異性核酸酶識別位點(diǎn)； 將供體核酸分子整合入可靶定核酸分子，其中可靶定核酸分子內(nèi)的整合包含至少一種 功能性標(biāo)志物基因；并 生成轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞包含可靶定核酸分子和整合的、包含至少一 種功能性標(biāo)志物基因的供體核酸分子。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中供體核酸分子包含第一和第二同源臂核酸序列。
41. 權(quán)利要求39的方法，其中第一同源臂核酸序列為內(nèi)含子。
42. 權(quán)利要求39的方法，其中第二同源臂核酸序列為非編碼多核苷酸序列。
【專利摘要】描述了一種工程化轉(zhuǎn)基因整合平臺(ETIP)，它能在植物基因組中隨機(jī)地或在靶定位置處插入，從而推動快速選擇和檢測完美靶定(5'和3'端二者)在ETIP基因組位置處的GOI。本公開文本中的一個要件是在ETIP內(nèi)引入特定雙鏈斷裂。在一些實(shí)施方案中，描述了一種ETIP，它使用鋅指核酸酶結(jié)合位點(diǎn)，但是可利用其它靶向技術(shù)，諸如大范圍核酸酶、CRISPR、TAL、或亮氨酸拉鏈。還描述了轉(zhuǎn)基因植物的組合物和用于生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中供體或有效載荷DNA表達(dá)穩(wěn)定整合入植物細(xì)胞中ETIP的外源核酸序列的一種或多種產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或RNA)。在多個實(shí)施方案中，從構(gòu)思貫穿開發(fā)階段，ETIP推動測試基因候選和植物表達(dá)載體。
【IPC分類】C12N15-29, C12N15-82, A01H5-00
【公開號】CN104838001
【申請?zhí)枴緾N201380054103
【發(fā)明人】N·科根, J·福斯特, M·海登, T·索布里奇, G·斯潘根伯格, S·R·韋布, M·古普塔, W·M·安利, M·J·亨利, J·梅森, S·庫馬爾, S·諾瓦克
【申請人】美國陶氏益農(nóng)公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2013年9月6日
【公告號】CA2883792A1, EP2893025A1, US20140090113, WO2014039872A1