提高脂肪酶耐有機溶劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高脂肪酶耐有機溶劑性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(EC 3.1.1.3)是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中的常用酶，在水環(huán)境中能夠催化脂鍵的水解，當(dāng)處于有機溶劑環(huán)境中能催化酯交換、酯化、轉(zhuǎn)脂和酰胺化等反應(yīng)，并具有區(qū)域選擇性、立體選擇性、較高的穩(wěn)定性，尤其是它的立體選擇催化特性，可以用于化學(xué)法難以進(jìn)行的消旋化合物的拆分、不對稱合成等。而脂肪酶作用的底物往往是水不溶性，在有機相中才有較好的溶解度，但是在有機溶劑中，介電常數(shù)會降低，隨之增加異性電荷的吸引力，使蛋白質(zhì)表面的基團(tuán)離子化程度減弱，使蛋白質(zhì)變性。大多數(shù)酶類在有機溶劑中活力受到抑制甚至失活，所以在生物催化中的應(yīng)用受到很大的限制。在有機介質(zhì)中維持較高的脂肪酶活性及脂肪酶催化底物的廣泛性是實際生物催化過程中的難題。
[0003]如何提高酶分子在有機溶劑中的穩(wěn)定性及活性的保持成了工業(yè)化應(yīng)用中的關(guān)鍵瓶頸。天然脂肪酶在反應(yīng)過程中催化性能容易受到底物、產(chǎn)物等其他因素的影響；在生產(chǎn)過程中一般都需要極端的操作條件，常用的脂肪酶在有機溶劑、高溫、高壓、極端pH等非天然環(huán)境條件下難以保持較高的活性和穩(wěn)定性。隨著脂肪酶在各個領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣，目前已知的種類和性質(zhì)已經(jīng)不能滿足生產(chǎn)需求。這些不利因素使脂肪酶難以進(jìn)一步實現(xiàn)規(guī)模化的工業(yè)應(yīng)用，因此提高脂肪酶的有機溶劑穩(wěn)定性及催化反應(yīng)速率，對整個行業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。
[0004]開發(fā)有機溶劑中脂肪酶具有高活性及高穩(wěn)定性是十分迫切的，可提升生物催化工程的關(guān)鍵理論與技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)對在有機溶劑中進(jìn)行酶催化的研宄著重于酶催化介質(zhì)工程，酶的物理化學(xué)修飾及固定化等技術(shù)，往往難以高效地改善酶的有機溶劑穩(wěn)定性及催化反應(yīng)效率。
[0005](I)固定化酶技術(shù)是實現(xiàn)此目標(biāo)的有效方法之一，在化工領(lǐng)域已經(jīng)有不少固定化脂肪酶的應(yīng)用。(見授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號CN 103232992 A)。
[0006](2)基因突變或定向進(jìn)化改造脂肪酶，獲得高催化性能的突變酶。(見授權(quán)中國申請，公告號 ZL102978182 A)。
[0007](3)化學(xué)修飾，其中聚乙二醇(PEG)是使用最廣泛的修飾劑。(見授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號 ZL 102559635 A)。
[0008](4)添加具有保護(hù)作用的小分子滲透劑，一般包括氧化三甲胺，甜菜堿，脯氨酸，山梨醇，甘油，糖類等。(見授權(quán)中國申請，授權(quán)公告號ZL 101225410 A)。
[0009]目前，海藻糖應(yīng)用于提高脂肪酶耐有機溶劑性的研宄尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在脂肪酶催化反應(yīng)的有機溶劑體系中添加海藻糖后，脂肪酶的耐有機溶劑性有所提高，基于此，發(fā)明人提出了本發(fā)明方案。而本發(fā)明也為解決有機溶劑中酶耐受性差、活力低等問題提供了相應(yīng)的解決方案。
[0011]具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種提高脂肪酶耐有機溶劑的方法，以脂肪酶為催化劑，在包含有有機溶劑的體系中對底物進(jìn)行催化反應(yīng)，其特征在于，在含有脂肪酶的有機溶劑體系中添加了海藻糖。
[0012]對于本發(fā)明中反應(yīng)體系可以理解為，存在反應(yīng)的底物，催化劑，S卩脂肪酶，以及反應(yīng)溶劑；其中包括優(yōu)選對底物進(jìn)行乳化的措施和添加物，目的在于提高底物在有機溶劑中與酶的接觸面積以及接觸效果等。
[0013]在本發(fā)明中，只要在反應(yīng)體系中添加了海藻糖，即可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。即可以理解為，在反應(yīng)的時機，如在反應(yīng)前、反應(yīng)開始后或者反應(yīng)結(jié)束前，在反應(yīng)的各必要組成物，如在底物、催化液或者酶液、有機溶劑或者反應(yīng)介質(zhì)、以及三者任一的組合中添加海藻糖均可以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0014]在優(yōu)選的一個實施方案中，以最終的酶催化反應(yīng)體系計，海藻糖在反應(yīng)體系中添加的濃度為0.25 -1.25 mol/Lo
[0015]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，催化體系中，所述有機溶劑體系為含有有機溶劑的乳化體系，脂肪酶存在于所述催化反應(yīng)的乳化體系中。
[0016]在本發(fā)明中，催化反應(yīng)為水解、酯交換、酯化、轉(zhuǎn)脂和酰胺化反應(yīng)中的一種。其中，對于催化反應(yīng)的實質(zhì)可以理解為酶與底物結(jié)合并使底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在添加了海藻糖的有機溶劑體系中，脂肪酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的直接證據(jù)。因此，對于反應(yīng)的類型的理解，應(yīng)理解為海藻糖存在時，或?qū)е旅附Y(jié)構(gòu)的改變，因此，反應(yīng)的類型應(yīng)該包括而不局限于水解反應(yīng)。
[0017]本發(fā)明所述脂肪酶為裙皺假絲酵母脂肪酶rugosa lipase, CRL)、南極假絲酵母脂肪酶(an tare ti calipase B, CALB)、根霉脂肪酶(TSizo/WAs lipase)、洋蔥假單胞菌脂肪酶(cepacia lipase, PCL)、豬胰脂肪酶(Porcinepancreas lipase, PPL)或洋蔥布克氏菌脂肪酶lipase, BCL)中的一種。
[0018]本發(fā)明所述的有機溶劑為乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、環(huán)己烷、乙醇、二甲基亞砜中的一種。
[0019]在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，底物包括甘油三酯，如橄欖油，底物優(yōu)選用阿拉伯樹脂膠與其形成乳化液。
[0020]在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，所述有機溶液體系中底物濃度為25% (v/v)甘油三酯，脂肪酶用量為4-18 μ g/mL，有機溶劑濃度為1%_60%。
[0021]在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，脂肪酶占所述脂肪酶酶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400-700μ g/mL。
[0022]在本發(fā)明的一個優(yōu)選方案中，所述催化溫度為30-50°C，反應(yīng)攪拌速率為200-400
轉(zhuǎn)/分鐘。
[0023]本發(fā)明的有益效果在于:
(I)通過本方案，可以有效提高脂肪酶對有機溶劑的耐受性，因此達(dá)到降低酶反應(yīng)催化成本的目的。
[0024](2)本發(fā)明提供的方案相對于化學(xué)修飾改造酶的分子結(jié)構(gòu)操作，工藝簡單易行，且酶能夠保持活力，而在化學(xué)修飾過程中酶易在失活；本發(fā)明相對于基因突變或定向進(jìn)化，周期短，具有針對性。本發(fā)明相對于分子伴侶作用，不需要添加能量(ATP);而且，不同的蛋白質(zhì)折疊過程中需要不同類型的分子伴侶，通用性較差。
[0025](3)對于本發(fā)明的可能原理，發(fā)明在實施例中進(jìn)行了進(jìn)一步公開，即通過添加海藻糖，脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)的變化，因此帶來了酶耐受性增強的有益效果。
[0026](4)但是對于本發(fā)明的原理進(jìn)一步原理，發(fā)明人只能推測，可能原因為(a)海藻糖通過形成玻璃態(tài)捕獲水分子保護(hù)生物膜和蛋白抵抗由于水去除造成最初水合作用受到破壞帶來的損傷。(b) “水替代”假說，海藻糖與蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)形成氫鍵，替代水化層水分子。(C) “優(yōu)先排阻”假說，海藻糖具有更大的優(yōu)先水合數(shù)，海藻糖被優(yōu)先排阻于蛋白質(zhì)表面，并利用蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用，增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。(d) “化學(xué)分子伴侶”假說，海藻糖不僅可以協(xié)助分子伴侶穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集，而且作為通用持久存在的伴侶，直接輔助蛋白質(zhì)折疊過程中形成柔性通道結(jié)構(gòu)域，增加非天然構(gòu)象的靈活性，緩解壓力條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)錯誤折疊。
【附圖說明】
[0027]圖1為CRL在乙腈中的催化穩(wěn)定性。
[0028]圖2為CRL含0，2%，3%乙腈中添加不同濃度海藻糖中的催化穩(wěn)定性。
[0029]圖3為CRL在含有2%乙腈中熒光強度的變化。
[0030]圖4為CRL在DMF中的催化穩(wěn)定性。
[0031]圖5為CRL含0，20%，30% DMF中添加不同濃度海藻糖中的催化穩(wěn)定性。
[0032]圖6為CRL在含有20% DMF中熒光強度的變化。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。所列的實施例僅作闡示之用，并表明本發(fā)明的精神和范圍并非限于此中的細(xì)節(jié)及其修改案。
[0034]實施例1
本實施例說明脂肪酶的來源。
[0035]本實施例中所用的脂肪酶均購自于Sigma公司，粉末狀。本專利所用的脂肪酶之一為 Candida rugosali^Q (CRL)，含有 549 個氨基酸，分子量約為 59.6 KDa, 36% α -螺旋和14%的β -折疊片